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A-2574-22- Andris Arias vs。卑尔根县L- ... A-0735-23-Jean Paul Joseph等。 VS.新泽西收费公路当局等。 L-1187-19和L-2089-19，联合县和全州 A-0522-23-Marcella Schembari vs。英石。迈克尔＆... 提起诉讼，上诉司的书记员，2024年5月14日，am- ... A-0363-23-Frank Lovato等。 VS.克利夫顿警察局等。 L-3006-20，Passaic县和全州 A-2138-22-Cassandra Gigi Smith Vs.纽瓦克社区卫生中心，Inc。L-0547-21，埃塞克斯郡和全州 A-0484-22-Laura Perry Bencivenga vs。 Barrett D. Bencivenga FM-07-2207-16，埃塞克斯郡和全州 N.J.S.A. 30：4-27.1 et seq。
克里斯蒂娜·费迪南德（Christina Ferdinand），单独，原告 - 诉新泽西收费公路机构，被告人反应人和新泽西州，联合县，克拉克乡镇，克拉克，拉赫韦市和温菲尔德公园，被告。于2025年2月5日提交 - 在Mayer和Puglisi法官面前决定。在新泽西州高等法院上诉中，法律部，联合县法律部，案卷L-1187-19和L-2089-19。 Kuhrt，Femia＆Kuhrt，LLC，上诉人律师（David W. Kuhrt，简介）。 McManimon，Scotland＆Baumann LLC和Decotiis Fitzpatrick Cole＆Giblin LLC，被告新泽西收费公路律师律师（Grant W. ）L-1187-19和L-2089-19。Kuhrt，Femia＆Kuhrt，LLC，上诉人律师（David W. Kuhrt，简介）。McManimon，Scotland＆Baumann LLC和Decotiis Fitzpatrick Cole＆Giblin LLC，被告新泽西收费公路律师律师（Grant W.
PRNP基因
参考•Caughey B，男爵GS。王室及其犯罪的伴侣。自然。2006年OCT19; 443（7113）：803-10。 doi：10.1038/nature05294。 引用于PubMed（https：//pubmed.ncbi.n lm.nih.gov/17051207）•Collinger J. Prion病的分子神经病学。 j Neurol Neurosurgpsphysyiartry。 2005 Jul; 76（7）：906-19。 doi：10.1136/jnnp.2004.048660。 PubMed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15965195）或PubMed Central上的免费文章（https：//www.ncbi.nlm.nlm.nih.gov/pmc/pmc/pmc/pmc1739714/）基因密码子129调节神经系统威尔逊病的临床过程。 NeuroReport。 2006年4月3日； 17（5）：549-52。 doi：10.1097/01.wnr.0000209006.48105.90。 引用于PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16543824）•harris da，true HL。 对prion结构和毒性的新见解。 Neuron.2006 5月4日; 50（3）：353-7。 doi：10.1016/j.neuron.2006.04.020。 PubMed引用（https：//pubm2006年OCT19; 443（7113）：803-10。 doi：10.1038/nature05294。引用于PubMed（https：//pubmed.ncbi.n lm.nih.gov/17051207）•Collinger J. Prion病的分子神经病学。j Neurol Neurosurgpsphysyiartry。2005 Jul; 76（7）：906-19。 doi：10.1136/jnnp.2004.048660。PubMed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15965195）或PubMed Central上的免费文章（https：//www.ncbi.nlm.nlm.nih.gov/pmc/pmc/pmc/pmc1739714/）基因密码子129调节神经系统威尔逊病的临床过程。NeuroReport。2006年4月3日； 17（5）：549-52。 doi：10.1097/01.wnr.0000209006.48105.90。引用于PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16543824）•harris da，true HL。对prion结构和毒性的新见解。Neuron.2006 5月4日; 50（3）：353-7。 doi：10.1016/j.neuron.2006.04.020。PubMed引用（https：//pubm
CRISPR使用霓虹灯电穿孔对永生的细胞系编辑
该方案描述了如何将核糖核蛋白（RNP）复合物组成，这些复合物由纯化的CAS9核酸酶复制，用化学改良的合成单导剂RNA（SGRNA）复制到永生的粘附或悬浮液中。包括一个敲门选项。RNP递送是使用Thermo Fisher Neon™转染系统完成的。包括各种细胞类型的电穿孔设置的参考。化学修饰的SGRNA旨在抵抗可导致细胞死亡的外核酸和先天的细胞内免疫级联反应。Editco化学修改的合成SGRNA具有特殊的纯度，并且始终驱动高编辑频率。
使用 24 孔板脂质体转染技术对含有 RNP 的永生化细胞系进行 CRISPR 编辑
本方案描述了如何将由纯化的 Cas9 核酸酶与化学修饰的合成单向导 RNA (sgRNA) 组成的核糖核蛋白 (RNP) 复合物递送至标准永生化细胞系（粘附或悬浮）。尽管针对 HEK293（人胚胎肾 293 细胞）进行了优化，但本方案可能适用于许多其他细胞系（例如 A549、U2OS、HeLa、CHO、MCF-7）。RNP 递送是使用 Lipofectamine™ CRISPRMAX™ 转染试剂完成的。化学修饰的 sgRNA 旨在抵抗核酸外切酶的降解并防止可能导致细胞死亡的先天性细胞内免疫级联。本方案可用于转染 EditCo 的多向导基因敲除试剂盒。
使用 RNP 在永生化细胞系中进行阵列式 CRISPR 多向导文库核转染
功能测定通常使用阵列式 CRISPR 筛选进行，以关联每种基因扰动对细胞功能、形态或生理学方面的影响。优化所选测定至关重要，以确保其能够可靠地识别感兴趣的表型。这可以使用测定特异性阳性和阴性对照来完成（参见第 5 页的建议对照表）。此外，优化 CRISPR 编辑和测定之间的时间也很重要，以确保可以测量清晰的表型信号。测定特异性阳性对照可用于此目的。
通过 CRISPR/Cas9 RNP 创造的长保质期甜瓜……
图 1 甜瓜植物体内 RNP 介导的基因组编辑。(a) 微粒介导的 GFP 基因转移到甜瓜 SAM。(b) 甜瓜基因组编辑 iPB-RNP 方法概述。(c) 携带目标 CmGAD1 基因座突变的阳性 E 0 植物的 CAPS 分析。符号“–”和“+”分别表示不使用和使用 Cas9 RNP 的消化。黑色和白色三角形分别表示 Cas9 RNP 处理后的未消化和消化条带。(d) 阳性 E 0 植物的 CRISPR/Cas9 靶序列与野生型的 CRISPR/Cas9 靶序列的比对，插入和缺失用红色字母突出显示。(e) 对来自两个 E 0 植物（#2-13 和 #2-16）的 E 1 植物进行基因特异性 CAPS 分析，使用与 (c) 中相同的符号。(f) 具有 gRNA 设计的 CmACO1 基因示意图。 (g) 针对 CmACO1 的基因组编辑实验总结。(h) cmaco1 纯合突变系 (#3-2，E 2 代) 的基因特异性 CAPS 分析，使用与 (c) 一致的符号。(i) 野生型和 cmaco1 中 CmACO1 的氨基酸序列比较，CRISPR/Cas9 的靶位点用下划线表示，序列变化用红色字母表示。星号表示终止密码子。(j 和 k) 收获后野生型和 cmaco1 果实的外观 (j) 和纵切面 (k)。(l) 授粉 40 天后测量的野生型和 cmaco1 果实 (E 2 代中的个体植物 E2-1 和 E2-2) 的乙烯产生量。数据以平均值±SE (n=3) 表示。
Marissa Decesaris Siegel（她/她），DNP，CRNP，PMHNP-BC ...
费城，pa mdeces@upenn.edu教育大学，匹兹堡，匹兹堡，宾夕法尼亚州匹兹堡，宾夕法尼亚州护理实践实践医学博士学位高管系统高管领导力，2024年荣誉：盖尔·A·沃尔夫·沃尔夫（Gail A. Wolf A. Wolf A. Wolf A.护理，2014年荣誉：Summa cum Laude，Dean的2010 - 2014年，护理本科荣誉计划，Hillman Family Foundation奖学金，FULD本科研究的机会（四）研究员，积极心理学本科生研究计划研究员，Mary D. Naylor D. Naylor本科生研究奖教授，2024年8月至今
20240806 CRISPR RNP 案例研究布局
与 CRISPR QC 合作为科学家提供了优化基因编辑策略的强大优势。我们的协作方法与我们的尖端平台相结合，可以全面评估 CRISPR 工作流程中的每个步骤。CRISPR 分析平台使科学家能够定量评估 gRNA 和 Cas 核酸酶复合物的结合和稳定性，确定 RNP 复合物与靶标（扩增子）DNA 之间的结合效率，测试靶标和非靶标 DNA 样本中的 RNP CRISPR 复合物裂解频率，并分析成功多重编辑的关键动力学排名。通过利用这些工具，我们可以帮助科学家快速获得可操作的见解，以优化他们的 CRISPR 策略。
使用核转染技术利用 RNP 对人类 iPS 细胞进行 CRISPR 编辑
• 建议戴上手套并使用无核酸酶试管和试剂以避免 RNase 污染。 • 始终保持无菌技术，并使用无菌过滤移液器吸头。 • 所有 EditCo 试剂应根据制造商的建议储存。 • 合成 sgRNA 应溶解在 TE 缓冲液中，并使用无核酸酶水稀释至工作浓度。请参阅 EditCo.com/resources 以查找与溶解和储存合成 sgRNA 相关的最佳实践。 • RNP 可直接在 Nucleofector™ 溶液中形成。 • RNP 复合物在室温下可稳定保存长达 1 小时（可在 4°C 下保存长达一周，或在 -20°C 下保存长达 1 个月）。请注意，在 4°C 下储存的 RNP 可能会在长时间后受到微生物生长的污染。
基于 RNP 的原代 CD4+T 细胞编辑...
电穿孔后 72 小时，可使用 BioLegend APC 抗人 TCR α / β 抗体通过流式细胞术评估用靶向 Edit-R sgRNA RNP 的 TRAC 或 TRBC 编辑的原代 CD4 + T 细胞的 TCR α / β 敲除情况。除了通过流式细胞术读取表型外，在基于 RNP 的编辑后 48-72 小时内，可以通过 T7EI/TIDE 测量插入/缺失形成。使用表 1 中列出的每个经过验证的 sgRNA 的引物，遵循 Dharmacon™ Edit-R™ 合成 gRNA 阳性对照试剂盒方案中的直接细胞裂解和 PCR 条件。要测量 T7EI 内切酶的插入/缺失形成，请完成上面列出的方案并使用分析软件。要通过分解 (TIDE) 分析跟踪插入/缺失来测量插入/缺失形成，请将得到的 PCR 扩增子发送至 Sanger 测序并使用网络工具，例如 http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ 。以下方案描述了用于通过流式细胞术评估原代 CD4 + T 细胞中 TCR α / β 表型敲除的染色条件。1. 通过离心（300-5 分钟）沉淀用 PPIB、NTC2、TRAC 或 TRBC 靶向 RNP 电穿孔的 CD4 + T 细胞