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奥尔堡大学高效基因编辑策略......
马铃薯 ( Solanum tuberosum ) 是一种高度多样化的四倍体作物。优良品种杂合性极强，品种内和品种间短片段多态性 (indel) 和单核苷酸多态性 (SNP) 的发生率很高，在 CRISPR/Cas 基因编辑策略和设计中必须考虑这些因素才能获得成功的基因编辑。在本研究中，对马铃薯品种 Saturna 和 Wotan 中葡聚糖水双激酶 (GWD)1 和抗霜霉病 6 (DMR6-1) 基因分别进行深入测序，结果显示与杂合二倍体 RH 基因组序列相比，四倍体与二倍体相比，存在 indel 和 1.3 – 2.8 的高 SNP 发生率。这使向导 RNA (gRNA) 和诊断性 PCR 设计变得复杂。细胞库（原生质体）水平的高编辑效率对于实现四倍体中的完全等位基因敲除以及减少下游繁琐而精细的植株再生至关重要。在这里，CRISPR/Cas 核糖核蛋白颗粒 (RNP) 通过聚乙二醇 (PEG) 介导的转化瞬时递送到原生质体中。对于 GWD1 和 DMR6-1 中的每一个，设计了 6 – 10 个 gRNA 来靶向包含两个基因的 5 ' 和 3 ' 端的区域。与包括多种生物体的其他研究类似，单个 RNP/gRNA 的编辑效率差异很大，并且一些产生了特定的插入/缺失模式。尽管与靶向 3′ 端相比，靶向 GWD1 5′ 端的 RNP 产生的编辑效率明显更高，但 DMR6-1 5′ 端和 3′ 端的编辑效率似乎有些相似。当仅靶向 GWD1 基因的 3′ 端时，同时用两个 RNP 靶向 5′ 端或 3′ 端（多路复用）对总体编辑产生了明显的正协同效应。与单个 RNP/gRNA 转化中获得的编辑效率相比，位于不同染色体上的两个基因的多路复用对单个 RNP/gRNA 编辑效率没有影响或略有负面影响。这些初步发现可能会引发更大规模的研究，以促进和优化植物的精准育种。
RNP复合物对细菌的作物保护...
•含有Cas9和GRNA的纳米配方，将外源喷涂到感染植物上。•核糖核蛋白（RNP）络合物的递送，该复合物靶向特定细菌毒性基因HRPX，HRPG，HRPB和HOPP1。•用于不同疾病的GRNA复合物的个体或组合。•所提出的技术靶向病原体毒力因子，以防止细菌枯萎病，导致小米的xanthomonas oryzae pv oryzae（XOO）在水稻上，细菌斑点，引起丁香肌pv。番茄dc3000在拟南芥和细菌枯萎病上，在马铃薯上引起拉尔斯托尼亚溶剂。•RNPS纳米配方具有增强的渗透和效率。•将RNP应用的管道和SOPS靶向细菌中的其他基因
工程慢病毒衍生的纳米颗粒（LVNP）用于...
使用CRISPR / CAS实施治疗性体内基因编辑，依赖于基因编辑工具的有效输送。由CAS蛋白和单个指南RNA（SGRNA）组成的核糖核蛋白（RNP）复合物提供了短期的编辑活性和安全优势，而不是惯性病毒和非病毒基因和RNA Delivery方法。通过工程慢病毒衍生的纳米颗粒（LVNP）促进RNP的递送，我们证明了SPCAS9以及SPCAS9衍生的基础和Prime Editor（BE / PE）的有效施用，从而导致受体细胞中的基因编辑。独特的GA G / GA GPOL蛋白融合策略促进了LVNP中的RNP包装，并确定LVNP stoichiometry y支持优化的LVNP收益率和治疗有效负载的纳入。我们将在4天内进行瞬时目标DNA C LEAV年龄，并在4天内完成RNP周转。结果，与培养细胞中标准的d rnp nuc Leofection相比，LVNP降低了靶向dna c leav年龄和tale of tar clea族的活性。lvnps可容纳be / sgrna和pe / epegrna rnps，导致基础编辑，旁观者编辑和质量编辑降低而无需检测到的indel indel形成。值得注意的是，在鼠标眼中，我们介绍了LVNP指导的体内基因破坏的第一个概念概念。我们的发现建立LVNP作为促进的车辆或促进RNP的交付
简讯 通过同源定向修复实现小麦体内精准基因组编辑
通过同源定向修复 (HDR) 进行的基因组编辑 (GE) 可以最大程度地灵活地修改基因组。先前的基因打靶 (GT) 研究表明，将带有供体模板的 Cas9 或 Cas12a 表达盒通过基因枪递送到水稻愈伤组织中，可以使用 HDR 途径在靶位点进行精确替换或插入 (Li et al., 2016 , 2018 , 2019 ; Lu et al., 2020 )。其他研究小组还报告在玉米 (Svitashev et al., 2016 ) 和大麦 (Lawrenson et al., 2021 ) 中成功创建 GT 植物。然而，这些策略仅适用于适合细胞培养和再生的基因型。为了规避与细胞培养和再生相关的限制，我们最近开发了植物内粒子轰击 (iPB) 方法，该方法允许在小麦中进行基因型独立的基因组编辑 (Hamada 等人，2017 年；Liu 等人，2021 年)。iPB 方法利用茎尖分生组织 (SAM)，其中包含注定在花发育过程中发育成生殖细胞的表皮下层 (L2) 细胞。成功将 Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 递送到 SAM 可促进基因组编辑的发生，并可遗传给下一代 (Kumagai 等人，2022 年)。由于 SAM 具有细胞分裂活跃的特点，许多细胞处于 HDR 的先决条件 G2/M 阶段，我们假设可以通过 iPB 方法将设计的供体 DNA 与 RNP 一起递送到小麦 SAM 中，实现基于 HDR 的 GT（图 1a）。
CRISPR-CAS9介导的人类天然杀伤细胞中的TIM3敲除增强对人神经胶质瘤细胞的生长抑制作用 血管紧张素II受体和Neprilysin抑制剂的组合通过预防肝星状细胞激活
摘要：胶质母细胞瘤（GBM）是成年人中最常见和侵略性的原发性恶性脑肿瘤。天然杀伤（NK）细胞是针对诱导GBM细胞的肿瘤细胞有效的细胞毒性细胞。因此，基于NK细胞的免疫疗法可能是GBM中有希望的靶标。t细胞免疫球蛋白粘蛋白家族成员3（TIM3）是在NK细胞上表达的受体，已被称为功能障碍NK细胞的标志物。，我们使用簇状的定期插入的短篇小学重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白9（CAS9）建立了NK细胞中的TIM3敲除。TIM3外显子2或外显子5靶向引导RNA- Cas9蛋白复合物（RNP）的电穿孔抑制了具有不同效率的NK细胞上TIM3表达。T7核酸内切酶I突变分解测定表明，这两个RNP都破坏了预期的基因组位点。其他检查点受体的表达，即编程细胞死亡1（PD1），淋巴细胞激活基因3（LAG3），具有Ig和ITIM结构域（TigIT）的T细胞免疫受体（TIGIT）和触觉（CD96）在TIM3基因敲除NK细胞上没有变化。实时细胞生长测定表明，TIM3基因敲除增强了NK细胞介导的GBM细胞的生长抑制。这些结果表明TIM3敲除增强了人类NK细胞介导的GBM细胞的细胞毒性。未来，NK细胞中的CRISPR-CAS9介导的TIM3敲除可能被证明是GBM患者的有前途的免疫治疗替代方案。
通过两性离子聚合物结合和肽融合最大限度地降低 CRISPR/Cas9 系统的脱靶频率
目前，CRISPR/Cas9 系统已广泛应用于各类生物和细胞的基因组编辑。1,2 遗憾的是，它还会在与靶序列相似的非靶位点引起不必要的突变。3 非靶突变是由 CRISPR/Cas9 RNPs 对 DNA 序列的非特异性识别引起的。4 已证明，除了最佳 PAM 序列 5-NGG-3 之外，Cas9 还可以切割具有 5-NAG-3 或 5-NGA-3′PAM 的位点，尽管效率较低。5 此外，20 nt 的单向导 RNA（sgRNA）可以识别与 sgRNA 存在多达 3 - 5 个碱基对错配的 DNA 序列，这表明在人类基因组中特定核酸酶的可能结合位点多达数千个。 3 此外，CRISPR/Cas9 可以诱导与 RNA 引导链相比含有一些额外碱基（“ DNA 凸起”）或一些缺失碱基（“ RNA 凸起”）的 DNA 序列进行非靶向切割。6 非靶向 DNA 切割可导致
RNA2024 - 爱丁堡
PLENARY and CONCURRENT SESSIONS Bioinformatics & Genomics Chromatin & Epigenetics Chemical Biology of RNA New Technologies Extracellular RNA Granules & Condensates High through-put discovery Interconnected RNA Processes Long Non-coding RNAs & Circular RNAs Origins of Life and evolution Regulatory RNAs in Bacteria & Archaea Ribosome Biogenesis & Modification Ribozymes & Riboswitches RNA & Cellular Immunity RNA & Disease RNA Modification & Editing RNA Nanotechnology RNA Structure, Folding & Modeling RNA Synthetic Biology & Systems Biology RNA Transport & Localization RNA Turnover RNPs: Biogenesis, Structure & Function Polyadenylation & 3′ end formation Small Non-coding RNAs in Eukaryotes Splicing Mechanism Splicing Regulation & Alternative用于治疗和诊断转录的靶向RNA靶向RNA：机理与生物学翻译机制翻译调节tRNA：处理和功能病毒RNAS
基因编辑
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
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然后使用“PEG 方法”将经过验证的 RNP 复合物（由单个 gRNA 和 [ ] 组成）转染到番茄原生质体中，该方法使用聚乙二醇促进 RNP 进入原生质体（Maas & Werr，1989）。进入细胞后，RNP 复合物被运输到细胞核并到达 gRNA 指示的特定目标。一旦达到目标序列，CRISPR-[ ] 酶将在 DNA 中产生双链断裂 (DSB)。当植物细胞修复断裂时，DNA 链中产生的单个断裂将重新连接，有时会导致 DNA 序列的缺失。几天后，RNP 复合物中的 CRISPR-[ ] 蛋白和 gRNA 将被植物细胞分解。
翠鸟柔性自动隔离病毒DNA/RNA的方案| neb
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。