靶序列,并使用 PrimeSTAR Max(TaKaRa,日本草津)的寡核苷酸和引物 sgRNA-RV 从 pDR274 载体 26 进行 PCR 扩增 sgRNA 模板,并使用 NucleoSpin 凝胶和 PCR 清理试剂盒(MACHEREY-NAGEL,德国迪伦)进行纯化。使用 CUGA7 gRNA 合成试剂盒(日本东京 Nippon Gene)合成 sgRNA,并使用 NanoDrop Lite 分光光度计(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 Thermo Fisher Scientific)测量其浓度。注射溶液由无 RNase 水中三种 sgRNA(每种 20 pg)、Cas9 蛋白(1 nM,M0646,美国马萨诸塞州新英格兰生物实验室)和酚红(P0290,Sigma-Aldrich)组成。将该溶液注射到1细胞期受精卵或4细胞期胚胎的细胞体中,产生遗传嵌合体,并
产品描述Quick-RNA™粪便/土壤微生物微型培养箱是一种创新产品,旨在快速隔离总RNA,包括小RNA(> 17 nt),从250毫克的土壤(污泥,沉积物等)和/或粪便样品(哺乳动物,禽类等)含有很难渗透的细菌,真菌,原生动物,植物,藻类,包括宿主在内的病毒。该套件包括独特的技术,例如ZR BashingBead™裂解管,并具有特殊配方的S/FRNA裂解缓冲液。Zymo-Spin™IIICG柱允许高容量核酸结合,随后的Zymo-Spin™IC柱有效吸附并浓缩总RNA。RNA洗涤,然后用DNase/RNase无水洗脱。用于去除抑制剂,可以通过将样品通过Zymo-Spin™III-HRC过滤器来处理洗脱的RNA。RNA在低至6 µL中洗脱,适用于包括RT-QPCR在内的后续程序。
必需的材料(不包括)1。纯化的人尿DNA:应根据制造商协议2.DNA保存解决方案3。荧光PCR仪器能够阅读FAM通道(494 nm最大吸收,518 nm最大发射),VIC通道(520 nm最大吸收,558 nm最大激发),ROX通道(580 nm最大吸收,最大吸收),623 nm最大兴奋)和CY5(640 nm nm最大吸收,640 nm最大吸收,682 nm)。4。Vortex Mixer 5。微输出式6。移液器7。无菌核酸酶的无动移液尖端(建议使用屏障尖端)和微型试管8。兼容PCR板9。与我们的技术支持团队联系以获取有关兼容性的问题:TechSupport@raybiotech.com样本要求1。所有人类尿液标本都应被视为潜在的感染性,并谨慎处理。在测试任何样本时,应采取措施根据风险评估来最大程度地降低实验室传播的风险。这些预防措施至少应包括熟练度和能力测试,适当的PPE,避免气溶胶以及使用有效的消毒剂(第四纪铵化合物和0.5%的漂白剂)。2。我们建议在微量离心机中在5000 g处离心1 ml尿液,在室温下10分钟,然后去除800 µL上清液。剩余的上清液和沉淀应用于DNA提取**。最终提取的DNA应在100 µL的DNase,无RNase无RNase水中洗脱。实时PCR程序需要每个反应的10 µL提取的DNA。3。提取的人尿DNA是该试剂盒的起始材料。应根据制造商方案将DNA与PCR分析设置分开纯化,并具有DNA保存溶液,以使细菌失活和保存DNA。**本手册中显示的数据是基于DNA提取的,使用Thermo Fisher Scientific的Magmax™病毒/病原体核酸分离试剂盒。一般考虑1。为防止PCR反应的污染,清洁和净化所有工作表面,离心机,移液器和其他具有10%漂白剂或DNAave®的设备,然后在每次测定之前为70%乙醇。
液氮 n/an/a 关键商业检测 NEBuilder® HiFi DNA 组装预混液 New England Biolabs E2621S BsaIHF®v2 (20 U/µL) New England Biolabs R3733S Phusion TM 高保真 DNA 聚合酶 Thermo Fisher Scientific F530S MluI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0561 ApaI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER1411 XhoI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0691 EcoRI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0271 RevertAid TM 逆转录酶 Thermo Fisher Scientific EP0441 RiboLock RNase 抑制剂 (40 U/μL) Thermo Fisher Scientific EO0381 NucleoSpin® 质粒试剂盒 Macherey-Nagel 740588.250 Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒 Zymo Research D4001 Zymo-Spin I Zymo Research C1003-250 嗜热菌 (Tth) DNA 聚合酶 Biotools 10.003 寡核苷酸 D1789 GGGAATCAATCACAGTGTTGGC
1) 将大肠杆菌培养液(高拷贝质粒:2-10 ml)离心(12,000 x g,30秒),弃上清,得到沉淀。 ↓ ②加入150 μl A1 buffer(加RNase A),涡旋悬浮细胞。 ↓ ③加入250μl A2缓冲液,颠倒混合5次左右,静置2分钟。 [裂解] ↓ ④ 加入350 μl A3缓冲液,颠倒混匀,直至液体由蓝色变为完全无色。检查是否没有蓝色残留,然后离心(12,000 x g,3 分钟)。 ↓ ⑤将上清液转移到NucleoSpin® Plasmid EasyPure 柱中,离心(1,000-2,000 × g,30 秒)。 [结合] ↓ ⑥ 加入450 μl AQ缓冲液(+EtOH)并离心(12,000 × g,1分钟)。 [洗涤/干燥] ↓ ⑦向柱中加入50 μl AE缓冲液,室温下放置1分钟。 ↓ ⑧ 离心(12,000×g,1分钟)回收质粒溶液。 [洗脱]
DNA提取在确定分子生物学的遗传问题中起着至关重要的作用。弗里德里希·米舍(Friedrich Miescher)于1869年在DNA上首次发现了粗糙的提取(Ali等人,2017年)。DNA提取的基本原理由几个步骤组成:(1)使用CTAB(Aboul-Maaty and Oraby and Oraby,2019)或SDS方法(El-Ashram等人,,2016年),而物理破坏,包括使用液氮隔离来研磨样品(Sahu等人,2012年)甚至酶促治疗,例如蛋白酶K(Sirkov,2016)和RNase(Tel- Zur等人。,1999; El-Ashram等。,2016年; Wang等。,2019年)可用于消除潜在的污染; (2)从细胞裂解物化合物中纯化DNA; (3)降水和DNA纯化(Dairawan and Shetty,2020年); (4)使用酒精和(5)含有低离子强度的溶液冲洗样品,通常使用Tris EDTA缓冲液溶解DNA并保护其免受降解。DNA提取方法可以使用
β-Mercaptoethanol PanReac-AppliChem A4338,0100 Sodium chloride (NaCl) PanReac-AppliChem 131659.1211 Tryptone Condalab 1612 Yeast Extract Condalab 1702 Bacteriological Agar Condalab 1800 Agarose D1 Medium EEO Condalab 8019 Liquid nitrogen n/a n/a Critical commercial assays NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs E2621S Phusion TM High-fidelity DNA polymerase Thermo Fisher Scientific F530S MluI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0561 BsaIHF®v2 (20 U/µL) New England Biolabs R3733S DNA Clean & Concentrator TM -5 Zymo研究D4004Nucleospin®质粒DNA纯化机构 - 纳格尔740588.250 Ribolock RNase抑制剂(40 u/μl)Thermo Fisher Scientific EO0381恢复TM逆转录(TM)逆转录酶Thero Fisher Fisher Fisher Scientific EP0441 Therus prolainsir prolapers themophirs dna Polymsisriast dna Polymsiss dna Prolymasse:003 3.003.003 3.003 3.003 3.003 3.003 3.003 3.003; 003 3.003 3.003 Nicotiana Benthamiana cas9(Bernabé-ortts等,2019)N/A寡核苷酸D2409 atttatattattAttCataCaatCaaAcc
NORGEN的纯化技术纯化基于自旋色谱柱色谱法。DNA优先从其他细胞成分(例如蛋白质)中纯化,而无需使用苯酚或氯仿。该过程涉及用液氮(或替代均质化设备)在砂浆中磨碎植物组织。裂解缓冲液L和RNase A,然后在65°C处进行短孵育,接下来,结合缓冲液I将添加到裂解物中,然后在冰上进行另一个短孵育。然后通过提供的过滤柱旋转裂解物,以清除任何碎屑。然后将乙醇添加到澄清的裂解物中,并将溶液加载到自旋柱上。Norgen的树脂以取决于离子浓度的方式结合核酸,因此只有DNA才能与色谱柱结合,而大多数RNA和蛋白质在流潮中除去。然后用提供的溶液WN洗涤结合的DNA并洗涤溶液A以去除剩余的杂质,并用洗脱缓冲液洗脱纯化的总DNA。纯化的DNA具有最高的完整性,可用于许多下游应用。
miRNA 参与各种生命过程,包括细胞生长、发育、凋亡、细胞分化和病理性细胞活动。循环 miRNA 可在各种体液中检测到,包括血清、血浆、唾液和尿液。值得一提的是,miRNA 在生物体液循环中保持稳定,并从膜结合囊泡(称为外泌体)中释放出来,保护它们免受 RNase 活性的影响。研究表明,miRNA 通过靶向紧密连接和粘附连接分子来调节血脑屏障的完整性,还可以影响炎症细胞因子的表达。最近的一些研究已经检查了多发性硬化症中某些常用药物对 miRNA 水平的影响。在这篇综述中,我们将重点关注 miRNA 在多发性硬化症中的作用的最新发现,包括它们在 MS 病因和疾病的分子机制中的作用、利用 miRNA 作为诊断和临床生物标志物、使用 miRNA 作为多发性硬化症的治疗方式或靶点以及患者的药物反应,阐明它们作为疾病进展预测指标的重要性,并强调它们作为未来 MS 治疗方法的潜力。
A. MARCOS、E. MUÑOZ-MARTINEZ、MT UNZAGA、J. L REY DE VIÑAS 和 G. VARELA。《蛋白质-热量缺乏的大鼠肝细胞变化》。Rev. esp. Fisiol.,40,165-170,1984 年。研究了低蛋白质-热量饮食(限制饮食)对 Wistar 大鼠肝脏细胞生长和 RNA 代谢的影响。实验进行了 30 天,并与营养良好的组(10% 蛋白质,对照组)进行了比较。营养不良大鼠的肝重和肝蛋白显著下降。DNA 率和细胞核数量均未改变。但是,蛋白质/DNA 和肝重/细胞核数量比率下降,导致萎缩现象。但是,DNase 比活性没有改变。缺乏该物质的大鼠肝脏 RNA 含量和 RNase 活性均下降。蛋白质合成能力(RNA/蛋白质)没有变化。这些结果表明,限制饮食会导致肝细胞体积减小,从而导致 RNA 转化率降低。
