启动子。为了研究热诱导的indels是否是启动子特异性的,我们测试了三个常用的本构启动子35S,RPS5A和Zmubi以驱动Cas9表达[34-36]。我们筛选了每个启动子-CAS9组合的9-14独立分离T2种群,以两到四个不同的GRNA靶向PDS3。我们观察到3xHS处理后,PDS3表型的数量和/或严重程度增加了Zmubi-Cas9(6/9独立线),RPS5A-CAS9(14/14独立线),35S- Cas9(6/12独立线)和PCUBI-CAS9和PCUBI-CAS9(7/9 Independed Line Independent lineption;图S4)。尽管表型对于35S-CAS9线的表型相对温和,但我们的数据与其他报道相一致,即热应力会提高与驱动CAS9的启动子序列无关的ideel效率[17,18,26]。热休克提高了烟草中的基因组编辑效率
CRISPR/LbCas12a系统(LbCpf1)被广泛应用于包括植物物种在内的基因组改造,但CRISPR/LbCas12a在不同植物物种和组织中的效率差异较大,编辑效率有待进一步提高。本研究通过优化crRNA表达策略和Pol II启动子,尝试提高CRISPR/LbCas12a在拟南芥中的编辑效率。值得注意的是,CRISPR/LbCas12a系统中tRNA-crRNA融合策略与RPS5A启动子的组合具有最高的编辑效率,而EC1f-in(crR)p驱动的CRISPR/LbCas12a的纯合突变体和双等位基因突变体比例最高。此外,所有纯合突变体和双等位基因突变体都可以稳定遗传到下一代,没有发生表型分离。本研究通过筛选出拟南芥中LbCas12a的最佳crRNA表达策略和启动子,提高了CRISPR/LbCas12a系统的编辑效率,为其他植物中CRISPR/LbCas12a方法的优化提供借鉴。
CRISPR 技术的发展为理解基本生物过程的进化和功能提供了强有力的工具。在这里,我们展示了在雌雄异株苔藓物种 Ceratodon purpureus 中成功的 CRISPR-Cas9 基因组编辑。利用远亲雌雄同体苔藓 Physcomitrium patens 的现有选择系统,我们通过使用 CRISPR 靶向诱变在天然 U6 snRNA 启动子表达下产生 APT 报告基因的敲除。接下来,我们使用天然同源定向修复 (HDR) 途径与 CRISPR-Cas9 相结合,在 C. purpureus 新开发的着陆点的内源性 RPS5A 启动子表达下敲入两个报告基因。我们的结果表明,在 P. patens 中开发的分子工具可以扩展到这个生态重要且发育多变的群体中的其他苔藓。这些发现为精确而有力的实验铺平了道路,旨在确定苔藓植物内部以及苔藓植物与其他陆地植物之间关键功能变异的遗传基础。
20 世纪 30 至 50 年代,核糖体首次被发现。科学家们认识到核糖体是异质性的,因为他们注意到用电子显微镜观察到的颗粒大小和形状存在差异[4]。一个假说进一步发展了这一模型,该假说描述了每个核糖体如何包含翻译一种蛋白质所需的遗传信息[5]。然而,随着这个假说被推翻和忽视,核糖体异质性模型也被推翻。将外来噬菌体 RNA 引入大肠杆菌后,细菌核糖体会进行翻译,这一发现支持了人们不再依赖核糖体特化模型的观点[6]。科学界普遍认为,核糖体是非特化的机器,能将任何 mRNA 转化为蛋白质。研究方法和技术的进步使得人们能够对核糖体进行更细致的研究,更清楚地表明核糖体的核糖体蛋白质 (RP) 组成可能存在异质性。 RP 组成的差异可能是由于特定 RP 同源物在不同组织或器官中的表达所致,例如拟南芥增殖组织中的 RPS5A 和 RPS18A [ 7 ] 出现在果蝇 [ 8 ] 和小鼠 [ 9 ] 的性器官中,并且随着细胞的不断分化和发育 [ 10 ]。此外,在小鼠中,RP 同源物 RPL39L(核糖体大亚基 L39 样蛋白)掺入核糖体会通过改变多肽出口通道的大小和电荷来影响翻译速度 [ 11 ],这有助于调节一组必需的雄性生殖细胞特异性蛋白质的折叠,而这些蛋白质是精子形成所必需的 [ 12 ]。在发育中的小鼠胚胎中,含有 RPL10A 的核糖体更倾向于经典 Wnt 信号通路成员的转录本,从而形成了一种特化,这对于发育过程中中胚层的正常产生至关重要 [ 13 ]。此外,虽然进化保守的核心 rRNA 在物种间保持高度保守,但人们认识到真核生物已经进化出包含扩展片段 (ES) 的 rRNA 序列。这些 ES 是从核心
