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使用SNAP标签靶向香豆素的荧光记者
线粒体是细胞内活性氧（ROS）产生的主要部位。ROS是重要的sig nalling分子，但产生过多会导致细胞损伤和功能障碍。因此，准确确定线粒体内产生ROS的何时，方式和地点至关重要。以前，ROS检测涉及各种化学探针和荧光蛋白。这些仅由于分子在线粒体基质中的积累而有局限性，或者需要为每个不同物种表达新蛋白质。我们报告动态H 2 O 2在所有线粒体子室内具有惊人空间分辨率的变化。我们将自标记蛋白的特定靶向与新型H 2 O 2-反应性探针相结合。该方法是宽范围且灵活的，具有相同的表达蛋白质可加载带有不同染料和传感器的蛋白质。它为其他化学物种（除了ROS之外的其他化学物种）提供了一个框架，其在线粒体内的DY NAMICS尚不清楚，而无需设计新蛋白质。
在人类血吸虫曼氏血吸虫的基因安全港进行定向插入和报告转基因活性
基因组安全港位点 (GSH) 的识别和表征旨在促进一致的转基因活动而不破坏宿主细胞基因组。我们结合基因组注释和染色质结构分析，通过计算方法预测四种 GSH 在人类血吸虫曼氏血吸虫（一种热带地区的主要传染性病原体）中的位置。使用 CRISPR/Cas 辅助的同源定向修复和重叠向导 RNA 将转基因引入寄生虫的卵中。观察到基因编辑效率为 24%，75% 的基因编辑血吸虫卵具有转基因编码荧光。这些结果通过提供一条使用同源定向修复催化转基因插入的转基因蠕虫的可处理途径，推动了血吸虫功能基因组学的发展。这种方法应该普遍适用于蠕虫。
在人类血吸虫曼氏血吸虫的基因安全港进行定向插入和报告转基因活性
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2023 年 1 月 4 日发布。；https://doi.org/10.1101/2022.09.02.506379 doi：bioRxiv preprint
APOBEC3B 报告骨髓瘤细胞系识别导致 APOBEC3B 表达的 DNA 损伤反应途径
载脂蛋白 B mRNA 编辑酶催化多肽样 (APOBEC) DNA 胞嘧啶脱氨酶 3B (A3B) 是一种 DNA 编辑酶，可诱导多发性骨髓瘤和其他各种癌症的基因组 DNA 突变。APOBEC 家族蛋白高度同源，因此研究癌细胞中 A3B 的生物学尤其困难。为了轻松全面地研究 A3B 在骨髓瘤细胞中的功能，我们使用 CRISPR/Cas9 生成了 A3B 报告细胞，其中包含 3 × FLAG 标签和整合在 A3B 基因末端的 IRES-EGFP 序列。这些报告细胞稳定表达 3xFLAG 标记的 A3B 和报告基因 EGFP，并且这种表达会受到已知刺激物（例如 PMA）的增强。相反，shRNA 敲低 A3B 会降低 EGFP 荧光和 3xFLAG 标记的 A3B 蛋白水平。我们利用这些细胞系筛选了一系列抗癌疗法，并发现大多数常规疗法（如抗代谢药物或放射疗法）会加剧内源性 A3B 表达，但最近的分子靶向疗法（包括硼替佐米、来那度胺和埃罗妥珠单抗）不会加剧内源性 A3B 表达。此外，在用抗代谢药物治疗时，ATM、ATR 和 DNA-PK 的化学抑制会抑制 EGFP 表达。这些结果表明 DNA 损伤通过 ATM、ATR 和 DNA-PK 信号传导触发 A3B 表达。
将RNAi与OSMYB76R用作候选基因的记者可以有效地创建和验证水稻中的男配子型男配子型
配子型男性无菌性（GMS）在对粘性核雄性无菌线的花粉发育和种子传播中对杂交水稻繁殖的环境条件不敏感的种子传播起着重要作用。由于GMS的固有表型和遗传特征，因此很难找到并识别GMS突变体。然而，由于基因转录数据的丰度，已经发现了大量花粉特异性基因，其中大多数可能与GMS有关。为了促进对花粉发育和杂种利用中这些基因的研究，在这项研究中，使用RNAi和OsmyB76R作为报告基因建立了一种简单而有效的创建和识别GMS的方法。首先，修改了参与花青素合成的OSC1 / OSMYB76基因，我们已经验证了修改后的OSMYB76R与预先模拟的OSMYB76基因相同。然后，使用RNAi驱动器驱动子驱动子，导致了异常的花粉管生长，使用RNAi抗坏血酸氧化酶基因OSPTD1。最后，RNAi元素与OSMYB76R相关联并转化为OSMYB76突变体，并在T 1和F 1代发现了紫色颜色分离的变形。这表明OSPTD1 GMS已成功制备。与当前方法相比，此方法有几个优点。首先，将时间保存在材料制备中，因为比在常规方法中比较一代人需要比较一代，因此可以避免突变筛选。最后，结果更准确，背景效果要低得多，并且对植物没有损害。此外，对于识别，成本较低；不需要PCR，电泳和其他过程；并且不需要昂贵的化学药品或仪器。结果是准备和识别GMS基因的简单，有效，低成本和准确的方法。
利用 CRISPR/Cas9 生成内源启动子驱动的荧光素酶报告系统，用于研究核心时钟基因 BMAL1 的转录调控
摘要：人类和其他生物体通过大气、饮用水、食物或直接接触不断接触成千上万种化学物质。这些化学物质中很大一部分浓度很低，即使在未观察到不良影响水平 (NOAEL) 下也可能产生协同作用。复杂的污染物混合物很难通过传统的毒理学方法进行评估。人们越来越关注不同污染物如何通过影响昼夜节律而诱导人体不良的生理功能。然而，从大量化学物质或其复杂混合物中筛选出具有昼夜节律破坏作用的化合物非常困难。我们通过 CRISPR/Cas9 建立了稳定的萤火虫荧光素酶报告基因敲入 U2-OS 细胞系，以筛选昼夜节律破坏污染物。荧光素酶基因插入核心时钟基因 BMAL1 下游并由内源启动子控制。与使用外源启动子的检测系统相比，这些细胞能够检测干扰 BMAL1 基因表达介导的昼夜节律系统的化合物。U2-OS 敲入细胞显示，当用 BMAL1 抑制剂和激活剂处理时，BMAL1 和荧光素酶活性发生了平行变化。此外，荧光素酶报告基因具有高灵敏度，比传统毒理学方法更快、更经济。敲入细胞系可用于高通量、高效筛选破坏昼夜节律的化学物质，例如药物和污染物。
工程THP-1细胞使纵向报告基因成像能够评估脱皮脂肪组织水凝胶作为人类单核细胞的递送平台
推荐引用推荐引用fadhil，al-shumoos，“工程THP-1细胞使纵向报告基因成像能够评估脱皮的脂肪组织水凝胶作为人单核细胞的递送平台”（2024）。电子论文和论文存储库。10645。https://ir.lib.uwo.ca/etd/10645
业界唯一证实有效降低off-Target
Donor Oligo 可置换约1 ～ 90nt 的长度Plasmid DNA donor Kit 可嵌入mKate Reporter 于任意指定位置应用： SNP/ insertion / deletion / protein fusion 研究
胎儿对母体炎症的反应需要小胶质细胞
图3。用大肠杆菌LASR和构成记者的甲醛活性。a。灰色线，甲醛依赖性生长抑制，占无甲醛的细胞的百分比。在大肠杆菌中与100 nm 3OC12-HSL的甲醛的剂量反应曲线在大肠杆菌培养物中具有阿拉伯糖诱导的LASR和LASR依赖性Lasi-Lacz Reporter（Black Line）或E. coli，或具有组成型APHA-3-LACZ RACZ REPORTER（RED RED REDERTER）。IC50值在表1中给出。结果显示，五个（LASR）或三个（LACZ控制）独立实验的平均值，误差线代表标准偏差。B.来自A的平均值（降低％降低％与Lasi-Lacz报告基因的抑制％），这些值用于确定Pearson的相关系数（R值）和显着性（P），并使用简单的线性回归模型生成拟合线。
引用方式：顾斌. 点亮胚胎：小鼠发育生物学的敲入报告基因生成. 动物繁殖. 2020;17(3):e20200055. https://doi.
发育生物学旨在了解单个细胞（受精卵）生成高度组织化的有机体的复杂调控过程。揭示这些过程本质的最有效方法是实时跟踪单个细胞和细胞谱系。成像设备、荧光标签和计算工具的最新进展使得对细胞和胚胎进行长期多色成像成为可能。然而，实现哺乳动物胚胎的实时成像仍面临一个重大挑战——生成携带报告基因的胚胎，以重现标记基因的内源性表达模式。基因组编辑技术的最新发展在实现高效生成报告小鼠模型方面发挥了重要作用。这篇简短的评论讨论了高效生成敲入报告小鼠的技术的最新发展以及这些模型在实时成像开发中的应用。随着这些发展，我们开始实现长期寻求的实时分析哺乳动物发育的前景。