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自动DNA剪切和图书馆准备...
使用8通道柔性通道ARM™（FCA）和多通道ARM™96（MCA96）的TECAN尖端开发了DNA剪切方法。FCA都存在于Dreamprep NGS配置（Dreamprep ngs和Dreamprep ngs compact）和Dreamprep ngs中的MCA中。在两种方法中都支持完整的样本数字灵活性（1至96个样本）和步入时间。关于实验室，TECAN导电过滤200 µL尖端（Tecan零件号30057815）和两种方法都需要特定的深井板。这些方法的协议被设计为通过带有TouchTools™的集成触摸屏可访问和访问，从而确保易用性。随后的图书馆准备工作流PACBIOSMRTBELL®PrepKit 3.0已经在Dreamprep NGS Compact上完全有资格处理多达48个样本，并且较大的Dreamprep ngs也可以使用一个相应的示例脚本，可以同时处理多达96个样品。
技术说明 - 使用 DNA Genotek Oragene 设备收集并使用 Nanobind 试剂盒提取的唾液 DNA 样本的 HiFi 测序性能
采集了 30 位捐献者的唾液样本，其中 90% 的分析前 DNA 质量 >2 µg。从 27 个样本中提取了 HMW DNA，其中 93% 的产量 >500 ng。提取后，使用 Qubit dsDNA BR 检测试剂盒对 DNA 进行定量，并使用 Femto Pulse 系统（安捷伦科技公司）进行表征。使用 SMRTbell ® 制备试剂盒 3.0 为部分样本制备 HiFi 文库，并使用 SPRQ™ 化学方法在 Revio 系统上进行测序。每个样本都在一个 Revio SMRT 测序池上进行测序。表 1 总结了五个代表性样本的测序数据。这些样本产生了 4.7 到 15.9 µg 的 HMW DNA。HiFi 测序产量为 119 到 133 Gb 的 HiFi 数据，每个基因组的覆盖率为 27 到 40 倍，足以进行全面的 WGS 变异检测。 75% 到 95% 的读数映射到人类参考基因组 (GRCh38)。
来自Ash Yellows Group
“ Cantidatus Phytoplasma Fraxini”的Ashy1菌株起源于伊萨卡（美国纽约，美国纽约），并于白灰（Fraxinus Americana），并被转移到Catharanthus Roseus（5）。使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）制备了由感染的玫瑰花芽芽孢杆菌和叶子材料制备的测序模板。使用SMRTBELL PREP KIT 3.0（美国加利福尼亚州PACBIO）的SMRTBELL PREP KIT 3.0（美国）而没有其他DNA片段化制备了用于单分子实时（SMRT）的高保真库。在Max Planck Genome-Centre（德国科隆）的续集IIE设备（PACBIO）上对片段文库进行了测序，其结合KIT 2.0（PACBIO）和续集II测序套件2.0（PACBIO）。通过使用BLAST+ v2.2.2.9，MetAgenome Analyze（Megan）和一个数据核定的数据，通过BLAST+ v2.2.2.9，MetAgenome Analyze（Megan）v.6.18.2（6.18.2（6.18.2）（6）（6）（6.6.18.2（6）的候选，分类构造分类为“ candidatus phyto plasma”属，其中11,518个读取（5834中的N 50）被分配给“念珠菌Phyto等离子体”属。 GenBank的Tus Phytoplasma”和Catharanthus Roseus（登记：2024年1月）。 使用PACBIO-HIFI选项和估计的基因组大小为600 kb，将其余的读数与CANU v2.2（7）组装在一起。 实现了一个连续的圆形序列，具有67.17倍的覆盖率。 通过爆炸分析确认了> 10 kb的序列重叠。 随后，使用Artemis V18.2.0（8）手动删除序列重叠。 在Rast V2.0（9）中进行了完整染色体的注释，然后在Artemis v18.2.0（8）中进行手动策划，DNAA将DNAA设置为染色体的第一个基因。 未发现质粒。通过BLAST+ v2.2.2.9，MetAgenome Analyze（Megan）v.6.18.2（6.18.2（6.18.2）（6）（6）（6.6.18.2（6）的候选，分类构造分类为“ candidatus phyto plasma”属，其中11,518个读取（5834中的N 50）被分配给“念珠菌Phyto等离子体”属。 GenBank的Tus Phytoplasma”和Catharanthus Roseus（登记：2024年1月）。使用PACBIO-HIFI选项和估计的基因组大小为600 kb，将其余的读数与CANU v2.2（7）组装在一起。实现了一个连续的圆形序列，具有67.17倍的覆盖率。通过爆炸分析确认了> 10 kb的序列重叠。随后，使用Artemis V18.2.0（8）手动删除序列重叠。在Rast V2.0（9）中进行了完整染色体的注释，然后在Artemis v18.2.0（8）中进行手动策划，DNAA将DNAA设置为染色体的第一个基因。未发现质粒。使用BUSCO的151个单拷贝直系同源物（94％）的比较支持了注释的完整性（10）。在染色体组装中未考虑的读数对额外的分类套筒进行了进一步的分类，并筛选了ASHY1的肉体外DNA。默认参数用于所有软件，除非另有说明。
厌氧硝酸盐还原的基因组草案，苯
Thermincola Mag的组装使用了多个先前报道的数据集（6）。Illumina配对端（NCBI登录：SRR24043423）和Mate-pair（NCBI登录：SRR24043417）读数是从2013年从称为NRBC亚养殖Cartcons19获得的。配对末端的读数进行了测序，并使用Nextera Mate Pair库制剂制备套件对配偶对读数进行了测序。使用Trimmomaticv。0.32（7）处理所有原始读数，然后使用Abyssv。1.3.7（8），以创建与All-Paths-LGv。4.7.0（9）中生成的脚手架合并的Unitigs，使用gap填充Perl Script（10）基于Tang S1中的script in Dang et et eT eT eT eT eT eT eT eT script。（11）。由于该元基因组组装中的不确定核苷酸数量大量（JARXNP010000000），因此采取了进一步的步骤。在2018年，使用HISEQ PE群集Kit v4 cbot（Illumina）对NRBC亚培养（FES-DIASIS）进行了测序，没有其他质量控制措施（NCBI登录：SRR24043422）使用IDBAv。1.1.1.1（12）（12）和BINNENNNEND和VINNEND。在157个重叠群（NCBI登录：Javsmv000000000.1）中分配给Thermincola的垃圾箱如前所述（6）。将这157个重叠群纳入上述深渊/全paths-lg间隙填充工作流程中，生成了一个26 contig组件，该组件是通过使用BBMAPv。38.94（14）来策划映射来解决歧义的26 contig组件。读取映射可视化是使用Geneiousv。8.1.8进行的，并使用NCBI的原始基因组注释进行了基因组注释Finally, long reads from a 2020 NRBC subculture called 10L-NRBC, sequenced according to the manufac turer's instructions using PacBio RSII with the SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0 ( SRR24043419 ) without shearing or size selection (Pacific Biosciences), were used to join adjacent contigs using the de novo assembly tool in Geneious v. 8.1.8（15），导致20碳组装。
评估HIFI长读取测序与整个基因组Bisulfite测序和甲基化史诗般的Beadchip阵列：利用DNA
DNA甲基化是最丰富，最广泛研究的表观遗传修饰之一，在各种生物学过程中起着至关重要的作用，例如发育，癌症，衰老和复杂疾病。在癌症基因组图集（TCGA）等大型队列研究中，Illumina阵列已被广泛用作高通量筛查的经典平台。但是，这种类型的阵列覆盖了人类基因组中的CpG位点的3％。最新一代的DNA测序技术以PACBIO HIFI系统为例，具有产生长序列读数的独特能力，最高为25千碱基。太平洋生物科学（PACBIO）的最新进步致力于提高每碱基准确性和检测DNA修饰的能力。在这项研究中，我们使用DNA甲基化标准评估了PACBIO HIFI测序的性能。由人DNA在CpG部位酶甲基化的DNA标准和未甲基化的人DNA源自HCT116 DKO细胞系。1 ug。样品被测序为约8倍覆盖范围。DNA甲基化数据，并使用PB-CPG-Tools从BAM文件中提取甲基化值。然后，我们比较了从PACBIO HIFI测序获得的结果与由史诗阵列和整个基因组亚硫酸盐测序（WGB）产生的结果。我们发现WGB和PACBIO HIFI天然DNA甲基化调用表现出很高的一致性，表现优于史诗般的阵列，这两种史诗阵列都与甲基化标准和报道的CPG数量一致。使用甲基化的标准样品，HIFI数据报告约有85％的CpG位点的甲基化比大于90％，平均基因组宽93％。同样，WGBS数据显示了约85％的CpG位点的甲基化比大于90％，平均基因组宽95％。相比之下，Epic阵列仅报告40％的CpG位点的甲基化比大于90％，而整个基因组中平均为87％。这些结果表明，HIFI长读取测序可以准确检测到接近100％甲基化的区域的DNA甲基化信号。我们的研究提供了对检测DNA甲基化模式的PACBIO HIFI测序表现的见解及其作为史诗阵列的替代方案的潜力。这项研究的发现说明了如何将DNA甲基化标准用作评估DNA甲基化调用模型的基础真实参考。