(ii) 如果水样浑浊度高,在使用套件中的滤膜过滤之前,使用孔径较大的过滤器进行额外的过滤步骤。孔径较大的过滤器可以堆叠在滤膜顶部。使用孔径较大的过滤器将过滤掉大颗粒,并允许孔径较小的滤膜捕获微生物。通过滤膜过滤尽可能多的样品。这将允许通过提取套件处理更多的样品;
(ii)如果水样品的浊度高,请使用较大的孔尺寸的过滤器采用额外的过滤步骤,然后使用试剂盒中的过滤膜进行过滤。孔径较大的过滤器可以堆叠在滤膜的顶部。使用较大的孔径的过滤器将过滤大颗粒,并使较小的孔径滤膜到捕获微生物。通过过滤膜过滤最高量的样品。这将允许通过提取套件处理更高量的样品;
虽然大多数样本类型的FastPrep®速度设置为4.0 m/s 20秒,但某些样品可能需要更严格的条件才能完全裂解。均质化速度和/或时间可以增加。当使用涡旋而不是FastPrep®进行裂解时,可以通过在溶液基质中进行涡旋之前在液氮中磨碎样品。涡旋持续时间也可以根据需要延长。
使用特殊配方的缓冲液MB1和裂解矩阵E与MP BioMedicals的FastPrep®仪器结合使用,可以在几秒钟内实现各种样品的有效裂解。在套件中提供的列MB和套件缓冲液旨在提供高产量和纯度的GDNA,并与QPCR,限制消化和测序等下游应用兼容。
图 1. DNA 质量。使用 SPINeasy DNA Pro 土壤试剂盒和/或竞争对手试剂盒 (Q pro) 处理具有不同生物量/污染物含量(每种 250 毫克)的土壤样品。中等生物量组包括在 -20°C 下储存 12-24 个月的样品,这可能会对分离的 DNA 的产量和完整性产生负面影响。当样品在检测范围内时,使用分光光度计重复四次评估 DNA 产量和纯度(A260/A280 和 A260/A230 比率)。图中的每个点代表一次提取。水平条表示中值。使用 DNA 凝胶评估 DNA 完整性。对于低生物量样品,加载了相似比例的 DNA 洗脱液,以比较 SPINeasy DNA Pro 土壤试剂盒和竞争对手试剂盒的性能。
注意:样品的核酸浓度是根据260 nm的紫外吸光度计算的,其中1(1 cm路径长度)等于50μlDNA/mL。对RNA,蛋白质,盐,乙醇和腐殖酸或其他非核酸污染物的污染促成260 nm处的总吸收,因此导致实际DNA浓度高估。使用紫外光谱法测量时,A260/A280的比率在1.80–1.90和A260/A230> 1.8之间表示纯DNA。A260/A280和260/230比率高于2.0的比例表示RNA污染。相反,A260/A280比1.8低于1.8表示蛋白质污染。此外,低的A260 / A230比表明腐殖酸可能存在,还可能存在蛋白质,糖,乙醇,盐和其他可能抑制后续酶促反应的污染物。
注意:样品的核酸浓度是通过其在 260 nm 处的紫外吸光度计算得出的,其中吸光度 1(1 cm 光程长度)相当于 50 μL DNA/mL。RNA、蛋白质、盐、乙醇或其他非核酸污染物的污染会导致 260 nm 处的总吸光度增加,因此会导致对真实 DNA 浓度的估计过高。使用紫外光谱测量时,A260/A280 比率在 1.80–1.90 之间且 A260/A230 >1.8 表示纯 DNA。A260/A280 和 A260/230 比率高于 2.0 表示 RNA 污染。相反,A260/A280 比率低于 1.8 表示蛋白质污染。此外,较低的 A260 / A230 比率表明存在腐殖酸以及蛋白质、糖、乙醇、盐和其他污染物,这些污染物可能会抑制后续的酶促反应。
图1。DNA质量。使用Spineasy DNA Pro试剂盒处理土壤和/或竞争者试剂盒(Q Pro),对具有各种生物量/污染物含量的土壤样品(每种250 mg)进行处理。培养基生物量组包括存储在-20°C的样品12-24个月,这可能会对分离的DNA的产量和完整性产生负面影响。当样品在检测范围内时,使用分光光度计评估了使用分光光度计评估DNA产量和纯度(A260/A280和A260/A230比率)。该图的每个点代表一个单个提取。水平条表示中值。使用DNA凝胶评估DNA完整性。对于低生物量样品,将类似比例的DNA洗脱素加载,以比较Spineasy DNA Pro套件用于土壤和竞争者试剂盒的性能。
将柱子转移到新的 DNA 和/或 RNA 洗脱管(已提供)中。向膜柱中心添加 100 μL 无 RNAse 的水,等待 1 分钟,然后以最大速度离心 1 分钟。RNA/DNA 样本现在可以用于下游应用了。注意:用 100 μL 无 RNAse 的水洗脱将最大程度地提高核酸的产量。为了获得更浓缩的样品,至少可以使用 50 μL 无 RNAse 的水。注意:样品的核酸浓度是通过其在 260 nm 下的紫外吸光度计算的,其中吸光度 1(1 cm 光程长度)相当于 50 μL DNA/mL。RNA、蛋白质、盐、乙醇、腐殖酸或其他非核酸污染物的污染会导致 260 nm 下的总吸收,因此导致对真实 DNA 浓度的估计过高。使用紫外光谱法测量时,A260/A280 比率在 1.80–1.90 之间且 A260/A230 >1.8 表示纯 DNA。A260/A280 和 A260/230 比率高于 2.0 表示 RNA 污染。相反,A260/A280 比率低于 1.8 表示蛋白质污染。此外,较低的 A260/A230 比率表示存在腐殖酸以及蛋白质、糖类、乙醇、盐和其他可能抑制后续酶促反应的污染物。
注意:样品的核酸浓度通过其在260 nm处的紫外吸光度计算,其中1(1 cm路径长度)等于50μlDNA/mL。对RNA,蛋白质,盐,乙醇或其他非核酸污染物的污染有助于在260 nm处的总吸收,因此导致对真实DNA浓度的高估。使用紫外光谱法测量时,A260/A280的比率在1.80–1.90和A260/A230> 1.8之间表示纯DNA。A260/A280和A260/230比2.0以上的比率表示RNA污染。相反,A260/A280比1.8低于1.8表示蛋白质污染。另外,低A260 / A230比表示存在腐殖酸以及蛋白质,糖,乙醇,盐和其他污染物,这些污染物可能会抑制后续的酶促反应。