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利用多种 V 型 CRISPR 进行无 PAM 诊断
V 型 CRISPR-Cas 效应子通过促进核酸生物标志物的检测，彻底改变了分子诊断。然而，它们依赖于目标双链 DNA (dsDNA) 上原间隔区相邻基序 (PAM) 位点的存在，这极大地限制了它们作为诊断工具的灵活性。在这里，我们提出了一种名为 PICNIC 的新方法，该方法只需对当代 CRISPR 检测方案进行约 10 分钟的简单修改，即可解决基于 CRISPR 的诊断的 PAM 问题。我们的方法包括通过高温和高 pH 处理将 dsDNA 分离成单个单链 DNA (ssDNA) 链。然后，我们以无 PAM 的方式使用多种 Cas12 酶检测释放的 ssDNA 链。我们通过成功将 PICNIC 用于 Cas12 家族的三种不同亚型（Cas12a、Cas12b 和 Cas12i）的无 PAM 检测，展示了 PICNIC 的实用性。值得注意的是，通过将 PICNIC 与含有 crRNA 的截短 15 核苷酸间隔区相结合，我们证明了使用 CRISPR 进行临床上重要的单核苷酸多态性的 PAM 独立检测。我们采用这种方法检测 HIV-1 的耐药变体（特别是 K103N 突变体）的存在，该变体在突变附近缺乏 PAM 位点。此外，我们成功地将我们的方法应用于临床样本，通过在 HCV 基因组中无 PAM 位点以 100% 特异性检测和基因分型 HCV-1a 和 HCV-1b 变体。总之，PICNIC 是一种简单但具有突破性的方法，它通过消除 PAM 序列的限制提高了基于 CRISPR-Cas12 的诊断的灵活性和精确度。
了解细菌中的DNA复制启动
DNA复制已被研究了数十年。过去15年是对复制起始复合物结构的深入探索和复制起始蛋白的作用机理的时期。多种研究模型（细菌染色体，质粒和噬菌体）已用于研究DNA复制起始，并且获得的结果使我们更加接近将有关此过程机理的难题放在一起。简单的Oric结构，其中包含DNAA的五个规范结合位点（R-Type DNAA-Boxes）（Fuller等，1984），已通过确定的此复制引发剂的其他结合位点进行了扩展（Kawakami等，2005，2005; Miller等； Miller等，2009; Rozgajaja; Rozgaja e et al。，2011）。发现了新活动，例如通过细菌复制启动器（DNAA和RCTB）在DNA放松元件（欠款）区域内的单链DNA（ssDNA）结合（Ozaki et al。，2008; Duderstadt et al。，2011; Chatterjee等，Chatterjee等，2020; DNAA和RCTB）。还确定了质粒复制引发剂（REP蛋白）（Wegrzyn等，2014）的核蛋白复合物与SSDNA的形成，并发布了复制启动器的新结构（Orlova等，2017; Wegrzyn等，20211）。尽管这些年来使用了许多新方法，并且对DNA复制的知识得到了扩展，但仍在讨论DNA复制启动的详细机制，并且仍然有许多问题需要回答。
PPI抑制剂的药理表征的最佳实践。
在接收P/N Cls157950：1小瓶40 µL SSDNA 7K 7K 7K梯子仅用于研究的情况下，在-25°C至-15°C下以-25°C至-15°C，仅用于研究用途，不用于诊断程序属性：无色解决方案，每瓶装：40 µL，总浓度：70 µL，NG/ng/ng。存储缓冲液组件：50 mm乙酸钾，20mm乙酸乙酸钾，10mm乙酸镁，20mm EDTA，〜6％甘油，pH〜7.8。存储：存储在-25°C至-15°C下。避免多个冻融周期。产品的等分试样可在2°C至8°C下最多存储一周。不要存放在无霜的冰箱中。处理：使用无DNase和无RNase试剂，DNA低结合管以及屏障移液尖端。融化说明：融化，最多可在37°C下完成，完全融化后几秒钟涡流，然后放在冰上。为避免多个冻融周期，请在无DNase和无RNase，DNA低结合管中制作等分试样，并具有典型的日常使用量。SSDNA 7K梯子在3个冻融周期后没有明显的稳定性损失。收到后的保质期：建议存储，直到在小瓶上指定到期为止。
可编程的无所不能的Argonaute核酸酶来自中介细菌Kurthia massiliensis
Argonaute（AGO）蛋白是生命所有领域中存在的保守核酸引导的蛋白质。真核生物Argonaute蛋白（EAGOS）是RNA干扰途径中的关键玩具，并且在生理温度下起RNA引导的RNA核酸内切酶的作用。尽管Eagos被认为是从原核蛋白质（Pagos）演变而来的，但先前研究的Pagos无法在生理温度下催化RNA引导的RNA裂解。在这里，我们描述了来自中粒细菌库尔西亚马西里尼斯（Kmago）的独特pago。kmago利用DNA指南裂解具有较高活性的单链DNA（ssDNA）和RNA靶标。kmago还利用RNA指南在适度的温度下裂解ssDNA和RNA靶标。我们表明，Kmago可以使用5'磷酸化的DNA指南，以切割SS-DNA和RNA，例如Butyricum of Of。小的DNA结合赋予了Kmago上的显着热稳定性，我们可以通过避免DNA指南加载温度来抑制空kmago的独立于导向的质粒加工活性。更重要的是，Kmago在37°C上执行双链DNA和高度结构化的RNA的可编程切割。因此，Kmago可以被视为一种DNA引导的可编程无内能力核酸酶，以使大多数类型的核酸有效地切断。这项研究扩大了我们对AGO蛋白质的理解，可以扩展基于Pago的DNA和RNA MA-MA-MA-MA-MA-MA-NIPULATION工具箱。
单链环状 DNA 治疗诊断
过去十年见证了核酸治疗和诊断（治疗诊断学）的蓬勃发展。与传统的小分子药物或蛋白质生物制剂不同，核酸治疗诊断学具有以下特征：作为“信息药物”，它具有编码和执行遗传和治疗诊断信息的内在能力、易于进行核酸工程编程、内在刺激或调节免疫调节、多功能功能以及在热变性或化学变性后易于构象恢复。单链环状 DNA (circDNA) 是一类具有共价闭合拓扑结构的单链 DNA (ssDNA)。除了核酸基材料的基本优势（例如低成本、生物相容性和化学修饰简单性）外，circDNA 中没有末端可防止核酸外切酶降解，从而相对于相应的线性 ssDNA 具有增强的生物稳定性。circDNA 已被用于多种治疗诊断应用。例如，circDNA 已被广泛研究作为生物分析信号扩增的模板和通过滚环扩增 (RCA) 和滚环转录 (RCT) 技术合成纳米/微米/宏观生物材料。circDNA 也被常用作多功能 DNA 折纸自组装的支架。最后，circDNA 已被用作治疗诊断适体、miRNA 抑制剂以及成簇的规律间隔的短回文重复序列 - CRISPR 相关蛋白 (CRISPR-Cas) 基因编辑供体。在这篇综述文章中，我们将讨论 circDNA（不包括双链环状 DNA，如质粒）的化学性质、特性和治疗诊断应用；我们还将展望该研究领域的挑战和机遇。
使用 MAD7TM 在大肠杆菌中进行基因编辑的快速入门指南
如果 MAD7 和 gRNA 由不同的载体编码，则可以依次（MAD7 然后是 gRNA）或同时将其转化为细胞。如果 MAD7 和 gRNA 在同一个载体中，只需将载体转化为细胞即可。根据需要进行基因编辑实验。注意：如果进行精确编辑，则需要 DNA 供体模板。DNA 供体可以是化学合成的单链 DNA (ssDNA) 或双链 DNA (dsDNA)，也可以克隆到表达 gRNA 的载体中。5' 和 3' 同源臂的长度取决于所需精确编辑的长度，可能需要针对您的系统进行优化。此外，Lambda Red（或其他重组酶）必须与 MAD7 共同表达才能实现最佳重组。
Rad51 独立的途径促进单链...
Rad51/RecA 重组酶家族在典型的双链断裂 (DSB) 修复中发挥着关键作用：切除的 DSB 末端进入同源双链 DNA (dsDNA) 模板序列以启动修复。然而，使用单链 DNA (ssDNA) 作为模板修复 DSB（CRISPR/Cas9 介导的基因编辑的常用方法）不依赖于 Rad51。我们通过使用位点特异性 HO 内切酶创建 DSB 并使用 80 nt 单链寡核苷酸 (ssODN) 修复 DSB，分析了酿酒酵母中这些不依赖于 Rad51 事件的遗传要求，并通过 Cas9 介导的 DSB 与在体内产生 ssDNA 模板的细菌逆转录子系统相结合证实了这些结果。我们表明，单链模板修复 (SSTR) 依赖于 Rad52、Rad59、Srs2 和 Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) 复合物，但与其他 Rad51 独立的重组事件不同，它不依赖于 Rdh54。我们表明，Rad59 可减轻 Rad51 对 Rad52 链退火活性的抑制，无论是在 SSTR 中还是在单链退火 (SSA) 中。当引入大小和序列相同的双链寡核苷酸作为模板时，基因编辑依赖于 Rad51。基因编辑过程中错配的吸收取决于 Msh2 的活性，它对 ssODN 3' 侧的作用与 5' 端非常不同，ssODN 可以直接退火到切除的 DSB 端。此外，DNA 聚合酶 Pol δ 的 3' 到 5' 校对活性经常切除非常靠近模板 3' 端的错配。我们进一步报告称，SSTR 会导致直接修复序列附近区域的突变增加多达 600 倍。这些 DNA 聚合酶 ζ 依赖性突变可能会损害基因编辑的准确性。
CRISPR 敲入协议 - 用于刺激人类 T 细胞......
注意：确保将 Cas9 蛋白作为反应中的最后一种材料添加。如果进行了敲除编辑，则无需添加 HDRT。表中 Cas9 与 sgRNA 的比例为 1:3。强烈建议对每个设计进行 Cas9：sgRNA 比例以及 Cas9 蛋白和 HDRT 的量进行实验优化。GenScript 建议通过测试 1:1 和 1:4 之间的 RNP 比例开始优化。ssDNA 或 dsDNA 的量可以分别最初设置在 1 μ g - 4 μ g 或 0.2 μ g - 1 μ g 之间（对于 0.5 kb 和 4 kb 之间的 HDRT；如果 HDRT 长度超出此范围，则需要相应调整试剂量）。最好为第一次实验设置阴性对照、阳性对照和转染对照。