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Sanger测序指南
在我们的实验室中，由Sanger进行DNA测序，客户为我们提供了PCR产品和底漆，以进行测序反应。应以5个1（最小体积为10 ul）的浓度输送引物，必须清楚地识别试管。要测序的样品必须具有最小体积为10 ul）。我们要求客户提供分子量标记凝胶和要测序的PCR产品的照片。此步骤确保在测序DNA之前对重量和质量进行验证。
将Sanger序列组装到参考
）在重叠群开始时放大残留物。将紧凑性设置为不紧凑的侧面面板，以便您可以看到每个读取的跟踪数据。单击侧面面板顶部的查找冲突按钮，或按Space键查找读数之间存在分歧的第一个位置；您也可以使用'，'和'。在冲突之间来回移动的密钥（见图7）。
用户指南：Sanger排序
PCR “strip” tubes ....................................................................................................................... 9 PCR 96-well plates ..................................................................................................................... 9 PCR 384-well plates ................................................................................................................... 9 Examples for sample and primer submission ................................................................................. 9 DNA S AMPLE P REPARATION .............................................................................................................. 14 P RIMER P REPARATION ..................................................................................................................... 16
通用引物列表DNA Sanger测序
Cogentech S.R.L.福利公司的成员属于IFOM的管理和协调 - 分子肿瘤学基金会通过Adamello 16，20139年意大利米兰 - 股本€1,100,000 i.v.本地单位：C/O SICILIL S.C.P.A.的科学和技术公园-Z.I。 Palma I Block，V。Lancia，57-95121 Catania P. Iva，C。F。和在米兰公司，Monza，Brianza和Lodi的公司登记册中注册。 04641450962 -R.E.A. MI-1763886 www.cugentech.it |序列service@cogentech.it | ph。 +39 02 57430 3210/3207-Z.I。Palma I Block，V。Lancia，57-95121 Catania P. Iva，C。F。和在米兰公司，Monza，Brianza和Lodi的公司登记册中注册。 04641450962 -R.E.A.MI-1763886 www.cugentech.it |序列service@cogentech.it | ph。+39 02 57430 3210/3207
桑格生命之树HMW DNA碎片：Covaris g- ...
本协议描述了通过生命HMW DNA提取方案制备的样品中的HMW DNA的离心介导的HMW DNA片段化。该协议使用Covaris g-tube产生8–10 kb尺寸范围的片段。剪切的DNA适用于下游长读取测序，包括超低输入（ULI）库制备后的PACBIO测序。这个过程对于生命树计划中所有分类学组的DNA提取物非常有效。该协议的输出是剪切的DNA，可以使用手动或自动SPRI协议将其针对碎片的DNA清除。
桑格生命之树HMW DNA提取：手动magAttract
该方案描述了从多种不同物种的多个不同组织样品中手动提取HMW DNA，不包括植物和真菌，用于使用Qiagen MagAttract HMW DNA提取试剂盒进行长阅读测序。此过程对于生命之树计划所涵盖的各种分类群体都是有效的。该方案对于组织可用性有限的样品特别有用，因为它始终从这些较小的样品中产生的DNA比等效的自动化方法更多。The output of this protocol is HMW DNA, which depending upon yield and the genome size of the species, can be directed towards HMW DNA Pooling, HMW DNA Fragmentation: Diagenode Megaruptor® 3 for LI HiFi, HMW DNA Fragmentation: Diagenode Megaruptor® 3 for LI PacBio or HMW DNA Fragmentation: g-Tube for ULI PacBio.
qSanger：通过桑格测序对细菌培养物中的遗传变异进行量化
所有培养生物体中都会自发出现突变和重组等遗传变异。虽然可以通过选择或反选择来识别非中性突变，但在异质群体中识别中性突变通常需要昂贵且耗时的方法，例如定量或液滴聚合酶链反应和高通量测序。在不断变化的环境条件下，中性突变甚至可能成为主导，从而强制进行暂时选择或反选择。我们提出了一种新方法，我们称之为 qSanger，使用来自混合 Sanger 测序读数的对齐电泳图峰的振幅比来量化 DNA。表达增强型绿色荧光蛋白和 mCherry 荧光标记的质粒用于通过定量聚合酶链反应和荧光定量在体外和共转化大肠杆菌中验证 qSanger。我们表明，qSanger 允许从混合 Sanger 测序读数中量化遗传变异，包括单碱基天然多态性或从头突变，与标准方法相比，大大减少了劳动力和成本。
sangerflow，一种基于桑格测序的生物信息学管道，用于害虫和病原体识别
为了在此处演示Sangerflow性能，我们使用了两个测试数据集，这些数据集由PCR Sanger测序前进和反向读取。首先，我们使用Geneious 6手动从前序列和反向序列中删除了模棱两可的核苷酸（表5），对它们排列，提取了共识序列，并最终使用Geneeious 6使用Web BlastN 16在NCBI数据库中搜索它们。然后，我们在同一数据集的FASTA文件上运行了Sangerflow管道，该数据集自动为每个示例提供了BLASTN输出（表6）。但是，由于sangerflow的输入和输出文件是FastA格式，因此对修剪序列没有可视化。最后，我们比较了sangerflow衍生的BLASTN输出与手动处理的输出（表7）。结果的比较证明了手动分析和桑格洛之间的一致性（表7）。
生命的桑格树碎片DNA清理：手动SPRI
使用sanger of Life of Life HMW DNA碎片剪切的DNA：DIAGENODEMEGAUPTOR®3用于PACBIO HIFI协议，使用0.6倍Ampure PB珠与DNA体积的比例。对于使用生命的Sanger树剪切的DNA HMW DNA碎片：DIAGENODEMEGAUPTOR®3用于LI PACBIO协议，使用1倍Ampure Pb珠与DNA体积的比例。对于使用生命的Sanger树剪切的DNA HMW DNA碎片：用于ULI PACBIO协议的G-Tube，使用0.6倍AMPURE PB珠与DNA体积的比例。为了允许执行QC并满足Sanger进行测序的内部需求，在步骤13中添加了49 µL的EB（3 µl为QC，45.4 µL用于测序），但是可以使用任何数量的EB缓冲液来洗脱剪切的DNA。
基于培养的和桑格测序方法，以发现新热带体育馆中叶子膜内生菌的多样性
基于培养和桑格的疗效的方法，以发现新热带体育馆内植物的多样性，巴拿马大学，自然科学学院，精确和技术学院，微生物学和寄生虫学系，巴拿马。 div>bethancourtita61@gmail.com https://orcid.org/0009-0006-6060-0640 Ariadna Bethancout，巴拿马大学，自然科学，精确和技术学院，精确和技术，微生物学和Parasitology，Panama。 div>ariadna.bethancourt@up.ac.pa https://orcid.org/0009-0009-6488-3264 lilisbethRodríguez-巴拿马大学，botany Spent，Botany Sletments，Panama，Panama Botany Sleotity，Panama，Panama。 div>lili_0990@outlook.es https://orcid.org/0000-0000-0002-4307-5956豪尔赫·门迪塔（Jorge Mendieta），巴拿马大学，自然科学学院，精确与技术学院，杂技，巴拿马植物学系。 div> mendi_ja@yahoo.es https://orcid.org/0009-0003-6576-5004 Armando A. Durant Archiboldlili_0990@outlook.es https://orcid.org/0000-0000-0002-4307-5956豪尔赫·门迪塔（Jorge Mendieta），巴拿马大学，自然科学学院，精确与技术学院，杂技，巴拿马植物学系。 div>mendi_ja@yahoo.es https://orcid.org/0009-0003-6576-5004 Armando A. Durant Archibold