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Schindele 等人 2022 - 增强基因编辑和......
Huang, T.-K.、Armstrong, B.、Schindele, P. 和 Puchta, H. (2021) 使用 CRISPR/SaCas9 和耐高温 LbCas12a 在烟草中实现高效基因靶向。植物生物技术杂志 19 , 1314–1324。Lawrenson, T.、Hinchliffe, A.、Forner, M. 和 Harwood, W. (2022)。使用新型 Lb Cas12a 变体在大麦中进行高效基因组编辑以及 sgRNA 结构的影响。 biorxiv 10.1101/2022.04.28.489853v1 Malzahn, AA, Tang, X., Lee, K., Ren, Q., Sretenovic, S., Zhang, Y., Chen, H., Kang, M., Bao, Y., Zheng, X., Deng, K., Zhang, T., Salcedo, V., Wang, K., Zhang, Y. 和 Qi, Y. (2019) 应用 CRISPR-Cas12a 温度敏感性改进水稻、玉米和拟南芥的基因组编辑。BMC 生物学 17、9。Merker, L.、Schindele, P.、Huang, T.-K.、Wolter, F. 和 Puchta, H. (2020) 使用耐温 CRISPR/LbCas12a 增强拟南芥植物体内基因靶向效率。植物生物技术杂志 18 , 2382–2384。Schindele, P. 和 Puchta, H. (2020) 改造 CRISPR/LbCas12a 以实现高效、耐高温的植物基因编辑。植物生物技术杂志 18 , 1118–1120。Weiss, T.、Crisp, PA、Rai, KM、Song, M.、Springer, NM 和 Zhang, F. (2022) 表观遗传特征极大地影响了 CRISPR-Cas9 在植物中的功效。植物生理学。
引文：Capdeville, N.、Schindele, P. 和 Puchta, H. (2020)。CRISPR/Cas 介导的碱基编辑在植物定向蛋白质进化中的应用
因此，已经开发出许多通过位点特异性DNA多样化实现基因及其产物定向进化的方法。其中许多方法，例如易错PCR、位点饱和诱变或嵌合体生成，都是基于序列文库的生成，然后在体外或体内筛选改良的蛋白质变体。然而，低转化率是这些方法的主要限制因素（Engqvist和Rabe，2019年）。使用可编程核酸酶的基因编辑方法的应用可以实现位点特异性的体内诱变，因此具有用于定向进化的潜力。目前，只有通过表征CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）/Cas9（CRISPR相关）系统，才能实现大规模的定向诱变，因为与以前的系统相比，该系统具有简单性、多功能性和高精度。