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World File Search SystemSpCAS9
Protac分子介导的SPCAS9蛋白质降解精确的基因组编辑Shengnan Sun 1,3，Renhong Sun 2,3，Minkang Tan 1，Maarten Kip 1，X
1。Araldi，R.P。等人，定期散布的短篇小说重复序列（CRISPR/CAS）工具的医疗应用：全面的概述。基因，2020年。745：p。 144636。2。Frangoul，H.，T.W。 ho和S. corbacioglu，CRISPR-Cas9基因编辑，用于镰状细胞疾病和β-杂质贫血。 回复。 n Engl J Med，2021。 384（23）：p。 E91。 3。 groenen，P.M.A。等人，DNA多态性的性质，在分枝杆菌 - 链球菌的直接重复簇中 - 通过一种新型分型方法施用应变分化的应用。 分子微生物学，1993。 10（5）：p。 1057-1065。 4。 Ishino，Y。等，IAP基因的核苷酸 - 序列，负责大肠杆菌中碱性磷酸酶同工酶的转化，以及基因产物的鉴定。 细菌学杂志，1987年。 169（12）：p。 5429-5433。 5。 Chen，J.S。 和J.A. doudna，Cas9及其CRISPR同事的化学。 自然评论化学，2017年。 1（10）。 6。 Doudna，J.A。 和E. Charpentier，带有CRISPR-CAS9的基因组工程的新领域。 科学，2014年。 346（6213）：p。 1077-+。 7。 Whinn，K.S。等人，Nuclease Dead Cas9是用于DNA复制的可编程障碍。 科学报告，2019年。 9。 8。 tsai，S.Q。等，指南seq可以通过CRISPR-CAS核酸酶对靶向裂解的全基因组进行分析。 自然生物技术，2015年。 9。Frangoul，H.，T.W。ho和S. corbacioglu，CRISPR-Cas9基因编辑，用于镰状细胞疾病和β-杂质贫血。回复。n Engl J Med，2021。384（23）：p。 E91。3。groenen，P.M.A。等人，DNA多态性的性质，在分枝杆菌 - 链球菌的直接重复簇中 - 通过一种新型分型方法施用应变分化的应用。分子微生物学，1993。10（5）：p。 1057-1065。4。Ishino，Y。等，IAP基因的核苷酸 - 序列，负责大肠杆菌中碱性磷酸酶同工酶的转化，以及基因产物的鉴定。细菌学杂志，1987年。169（12）：p。 5429-5433。5。Chen，J.S。 和J.A. doudna，Cas9及其CRISPR同事的化学。 自然评论化学，2017年。 1（10）。 6。 Doudna，J.A。 和E. Charpentier，带有CRISPR-CAS9的基因组工程的新领域。 科学，2014年。 346（6213）：p。 1077-+。 7。 Whinn，K.S。等人，Nuclease Dead Cas9是用于DNA复制的可编程障碍。 科学报告，2019年。 9。 8。 tsai，S.Q。等，指南seq可以通过CRISPR-CAS核酸酶对靶向裂解的全基因组进行分析。 自然生物技术，2015年。 9。Chen，J.S。和J.A.doudna，Cas9及其CRISPR同事的化学。自然评论化学，2017年。1（10）。6。Doudna，J.A。 和E. Charpentier，带有CRISPR-CAS9的基因组工程的新领域。 科学，2014年。 346（6213）：p。 1077-+。 7。 Whinn，K.S。等人，Nuclease Dead Cas9是用于DNA复制的可编程障碍。 科学报告，2019年。 9。 8。 tsai，S.Q。等，指南seq可以通过CRISPR-CAS核酸酶对靶向裂解的全基因组进行分析。 自然生物技术，2015年。 9。Doudna，J.A。和E. Charpentier，带有CRISPR-CAS9的基因组工程的新领域。科学，2014年。346（6213）：p。 1077-+。7。Whinn，K.S。等人，Nuclease Dead Cas9是用于DNA复制的可编程障碍。科学报告，2019年。9。8。tsai，S.Q。等，指南seq可以通过CRISPR-CAS核酸酶对靶向裂解的全基因组进行分析。自然生物技术，2015年。9。33（2）：p。 187-197。Wang，Y。等人，CRISPR系统的特异性分析揭示了脱靶基因编辑的大大增强。科学报告，2020年。10（1）。10。Zuccaro，M.V。等人，在人类胚胎中Cas9裂解后的等位基因特异性染色体去除。单元格，2020。183（6）：p。 1650-+。11。Aschenbrenner，S。等人，将Cas9耦合到人工抑制域增强了CRISPR-CAS9目标特异性。科学进步，2020年。6（6）。12。Bondy-DeNomy，J。等人，抗Crispr蛋白抑制CRISPR-CAS的多种机制。自然，2015年。526（7571）：p。 136-9。13。Khajanchi，N。和K. Saha，通过小分子调节进行体细胞基因组编辑，控制CRISPR。mol ther，2022。30（1）：p。 17-31。14。Han，J。等人，对小分子药物的超敏反应。前疫苗，2022年。13：p。 1016730。15。Pettersson，M.和C.M. 机组人员，针对嵌合体的蛋白水解（Protacs） - 过去，现在和未来。 Div drug Discov Today Technol，2019年。 31：p。 15-27。 16。 Bondeson，D.P。 和C.M. 机组人员，小分子靶向蛋白质降解。 药理学和毒理学年度评论，第57卷，2017年。 57：p。 107-123。 17。 li，R。等人，癌症治疗中的蛋白水解靶向嵌合体（Protac）：现在和未来。 分子，2022。 27（24）。 18。Pettersson，M.和C.M.机组人员，针对嵌合体的蛋白水解（Protacs） - 过去，现在和未来。Div drug Discov Today Technol，2019年。31：p。 15-27。16。Bondeson，D.P。 和C.M. 机组人员，小分子靶向蛋白质降解。 药理学和毒理学年度评论，第57卷，2017年。 57：p。 107-123。 17。 li，R。等人，癌症治疗中的蛋白水解靶向嵌合体（Protac）：现在和未来。 分子，2022。 27（24）。 18。Bondeson，D.P。和C.M.机组人员，小分子靶向蛋白质降解。药理学和毒理学年度评论，第57卷，2017年。57：p。 107-123。17。li，R。等人，癌症治疗中的蛋白水解靶向嵌合体（Protac）：现在和未来。分子，2022。27（24）。18。Farasat，I。和H.M. SALIS，一种CRIS/CAS9活性的生物物理模型，用于基因组编辑和基因调节的合理设计。 PLOS Comput Biol，2016年。 12（1）：p。 E1004724。Farasat，I。和H.M. SALIS，一种CRIS/CAS9活性的生物物理模型，用于基因组编辑和基因调节的合理设计。PLOS Comput Biol，2016年。12（1）：p。 E1004724。
如何使用基因组编辑工具生成等位基因系列
基因组编辑工具极大地促进了通过靶向诱变对目标基因进行功能分析。现在有许多可用的基因组编辑工具，包括不同的位点特异性核酸酶和允许在给定位点引入单核苷酸多态性 (SNP) 的编辑器数据库。这些工具可用于在给定基因座产生高等位基因多样性，以促进基因功能研究，包括检查特定蛋白质结构域或单个氨基酸的作用。我们比较了我们的 LbCPF1、SpCAS9 和碱基编辑器 (BECAS9) 构建体对 OsCAO1 基因产生的效果、效率和突变类型。SpCAS9 和 LbCPF1 在产生突变方面具有相似的效率，但在诱导的突变类型上有所不同，对于 SpCAS9 和 LbCPF1，大多数变化分别是单核苷酸插入和短缺失。杂合子的比例也不同，在我们的 LbCPF1 中占大多数，而使用 SpCAS9，我们获得了大量双等位基因突变体。最后，我们证明了使用 BECAS9 可以特异性地引入终止密码子，可接受的效率约为 20%。基于这些结果，可以根据希望引入的突变类型在这三种替代方案中进行合理的选择，这三种系统是互补的。SpCAS9 仍然是在初级转化体中产生 KO 突变的最佳选择，而如果所需的基因突变干扰再生或生存能力，则将优先使用我们的 LbCPF1 构造，因为它主要产生杂合子。其他研究已将 LbCPF1 描述为在产生纯合和双等位基因突变方面与 SpCAS9 一样有效。未来仍有待澄清，不同的 LbCFP1 构造是否具有不同的效率并确定这些差异的来源。最后，如果希望专门引入终止密码子，BECAS9 是一种可行且有效的替代方案，尽管它在创建 KO 突变方面的效率低于 SpCAS9 和 LbCPF1。
CRISPR-Cas9 载体
CRISPR/Cas9系统已被广泛应用于基因组编辑，包括基因破坏、定点诱变、表观遗传调控等。化脓性链球菌（SpCas9）是目前最常用的Cas9蛋白。通过SpCas9进行基因组编辑需要在靶位点有一个“NGG”原型间隔区相邻基序（PAM）序列，这限制了CRISPR/Cas9系统的编辑范围。为了扩大编辑位点的范围和优化编辑特异性，各种SpCas9突变体已被研究并成功应用于CRISPR系统。
利用-QM-MM和分子型模拟 -
图2。DNA，SGRNA和蛋白质相互作用（a）（a）匹配的SPCAS9和（b）MM5-SPCAS9聚焦HNH催化位点和PAM（NGG）区域。（C＆D）显示了匹配的和MM5的不同视图，从而缩放了PAM远端和RUVC区域相互作用。T-DNA，NT-DNA和SGRNA分别为颜色的洋红色，黄色和浅蓝色。SPCAS9，HNH和RUVC的两个核酸酶结构域以白色和深蓝色显示。
组合 CRISPR 筛选的比较优化
组合 CRISPR 技术已成为一种变革性方法，可系统地探测冗余基因对的遗传相互作用和依赖性。然而，不同的功能基因组工具在多路复用 sgRNA 方面的表现差异很大。在这里，我们生成并基准测试了十个不同的组合 CRISPR 文库，这些文库以同源物对为目标，以优化双基因敲除筛选。评估了由双化脓性链球菌 Cas9 (spCas9)、正交 spCas9 和金黄色葡萄球菌 (saCas9) 以及 Acidaminococcus 的增强型 Cas12a 组成的文库。我们证明了来自 spCas9 的替代 tracrRNA 序列的组合始终表现出优越的效应大小和 sgRNA 之间的位置平衡，这是一种强大的组合方法来分析多个基因的遗传相互作用。
影响 AAV 介导的 CRISPR 功效的因素...
频繁注射抗血管内皮生长因子 (anti-VEGF) 药物对患有新生血管性年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的患者来说是一种临床负担。使用腺相关病毒 (AAV) 递送成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas9 对 VEGF-A 进行基因组破坏有可能永久抑制异常血管生成，但决定最佳疗效的因素尚不清楚。在这里，我们研究了两种广泛使用的 Cas9 内切酶 SpCas9 和 SaCas9，并评估了 AAV 递送效率和体内基因组编辑率的相对贡献，以确定驱动基于 CRISPR 成功抑制 VEGF-A 的机制，使用激光诱导脉络膜新生血管 (CNV) 的小鼠模型。我们发现，尽管 SpCas9 的双载体方法和 SaCas9 的单载体系统在传递 Cas9 直系同源物和单个向导 RNA (gRNA) 方面的 AAV 转导效率相似，但 SpCas9 表现出比 SaCas9 更高的基因组编辑率、更大的 VEGF 减少率和更有效的 CNV 抑制。我们的结果表明，使用 AAV 介导的 CRISPR 系统成功敲低 VEGF 可能更多地取决于基因组编辑的效率，而不是病毒转导，并且 SpCas9 可能比 SaCas9 更有效，可作为基于 CRISPR 治疗新生血管性 AMD 中 CNV 的潜在治疗策略。
一个基因组还是数千个基因组？群体基因组学和脱靶风险
使用 SpCas9 核酸酶进行 ONE-seq 脱靶分析的结果 a，群图显示五个先前分析的 SpCas9 gRNA 的 ONE-seq 核酸酶分数。每个圆圈代表一个单独的 ONE-seq 文库成员。彩色圆圈代表先前确认的真正脱靶位点。未显示 ONE-seq 核酸酶分数低于 0.001 的位点。n/a，未在先前发表的 CIRCLE-seq 研究中进行验证。b，维恩图比较了 ONE-seq、CIRCLE-seq 和 Digenome-seq（空心彩色圆圈）提名先前由 GUIDE-seq（实心紫色圆圈）验证的真正脱靶位点的能力。所有被视为由 ONE-seq 验证的位点的 ONE-seq 核酸酶分数均 >0.01。
通过腺病毒载体转移优化的 CRISPR-Cas9 成分整合基因传递和基因编辑技术
摘要 增强 RNA 引导的 CRISPR-Cas9 核酸酶 (RGN) 的细胞内递送和性能仍然有需求。在这里，我们表明常用的化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 蛋白的核转位并不理想。因此，我们通过为高特异性 eSpCas9(1.1) 核酸酶 (eCas9.2NLS) 赋予额外的核定位信号 (NLS) 来生成 eCas9.4NLS。我们证明与原型或优化的引导 RNA 偶联的 eCas9.4NLS 可实现有效的靶向 DNA 切割，并探究具有不同 NLS 组成的 SpCas9 蛋白在异染色质和真染色质中嵌入的靶序列上的性能。此外，在腺病毒载体 (AdV) 介导的 SpCas9 表达单元转移后，无偏定量免疫荧光显微镜显示 eCas9.4NLS 核富集水平比高特异性 eCas9.2NLS 的核富集水平高 2.3 倍。这种改进的核易位反过来在非同源末端连接修复靶向双链 DNA 断裂后产生了强大的基因编辑。具体而言，AdV 将 eCas9.4NLS 递送到肌肉祖细胞中，导致有缺陷的 DMD 等位基因（导致杜氏肌营养不良症 (DMD)）的编辑频率明显高于编码亲本 eCas9.2NLS 蛋白的 AdV 所实现的编辑频率。总之，这项工作为整合病毒载体和优化的基因编辑技术以增强 RGN 递送和性能提供了强有力的理论基础。
肽融合提高主要编辑效率 1
Prime editing 是一种基于 CRISPR 的“搜索和替换”技术，可在没有双链断裂 (DSB) 或供体 DNA 模板 1 的情况下，在哺乳动物细胞中介导靶向 32 插入、删除和所有可能的碱基对碱基转换。Prime editing 34 酶 (PE2) 由与工程逆转录酶 (RT) 融合的 SpCas9 切口酶组成。35 PE2 通过 Prime editing 向导 RNA (pegRNA) 被招募到目标位点，该 RNA 除了标准基因组靶向间隔区和 SpCas9 结合发夹结构外，还包含 3' 序列，37 该序列充当融合 RT 的模板，以在一条切口 DNA 链上合成编程的 DNA 序列。当细胞 DNA 修复机制修复断裂的链时，这种 RT-39 延伸片段会与未编辑的片段竞争，而编辑后的序列有时会取代基因组中的原始序列 1,2。41
碱基编辑作为脊髓性肌萎缩症的基因治疗方法
图 1. 开发腺嘌呤碱基编辑来纠正 SMN2 外显子 7 C6T。a、未受影响个体和脊髓性肌萎缩症 (SMA) 患者的 SMN1 和 SMN2 示意图。SMN1 中的突变会导致 SMA，因为 SMN 蛋白会消耗，而这可以通过编辑 SMN2 来恢复。b、与 SMN1 相比，SMN2 外显子 7 C 到 T (C6T) 多态性的示意图，其中有碱基编辑器 gRNA 靶位及其估计的编辑窗口。cd、当使用由腺嘌呤脱氨酶结构域 ABEmax 33,38、ABE8.20m 35 和 ABE8e 36 与野生型 SpCas9（面板 c）或 SpRY 37（面板 d）融合的 ABE 时，对 SMN2 C6T 靶向腺嘌呤和其他旁观者碱基进行 A-to-G 编辑，通过靶向测序进行评估。 e，使用 SpRY 或其他宽松 SpCas9 PAM 变体 43 对 SMN2 外显子 7 中的腺嘌呤进行 A 到 G 编辑，通过靶向测序进行评估。图 ce 中的数据来自 HEK 293T 细胞中的实验；n = 3 个独立生物学重复的平均值、sem 和单个数据点。