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World File Search SystemSpCAS9
SMOOT 文库和噬菌体诱导的 Cas9 定向进化可减少脱靶活性
RNA 引导的核酸内切酶（如 Cas9）可在细胞中提供有效的靶向基因组编辑，但也可能切割整个基因组中的脱靶位点。化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 的工程变体已被开发出来以全面降低脱靶活性，但个别脱靶可能仍然存在，或者靶向活性可能受到损害。为了在保持强大的靶向编辑的同时对抗特定脱靶的活性，我们开发了一种新颖的 M13 噬菌体介导选择方法。使用这种方法，连续几轮正向和负向选择用于识别增强或减弱特定基因组序列编辑活性的 Cas9 突变。我们还引入了寡核苷酸定向靶标扫描诱变 (SMOOT)，这是一种全面的诱变方法，用于创建高度多样化的 Cas9 变体库，这些库可以通过基于噬菌体的选择进行挑战。我们的平台识别出新的 SpCas9 突变体，这些突变体在生化测定和 T 细胞中减轻了对脱靶的切割，同时保持了比以前描述的变体更高的靶向活性。我们描述了一种进化的变体，S . pyogenes Adapted to Reduce Target Ambiguity Cas9 (SpartaCas)，它由最丰富的突变组成，每个突变的功能未知。这种进化的 Cas9 突变体减少了脱靶切割，同时保留了对多个治疗相关靶标的有效编辑。使用我们的系统对 Cas9 进行定向进化展示了一种改进的结构独立方法，可以有效地设计核酸酶活性。
体内外毛细胞基因的补充信息...
图 S1. Kcnq4 W276S/+ 小鼠的静纤毛形态和野生型小鼠耳蜗中的 Kcnq4 表达。图 S2. 靶向 Kcnq4 突变等位基因的候选 sgRNA。图 S3. 优化 sgRNA 以进行体内基因编辑。图 S4. SpCas9 和 sgRNA 的双分裂 AAV 系统。图 S5. 优化体内基因编辑的递送途径。图 S6. SpCas9 在耳蜗毛细胞中的转染。图 S7. 将 AAV 和 RNP 注射到中耳阶的安全性。图 S8. 通过 AAV 注射进行体内基因编辑后 Kcnq4 W276S/+ 中的听觉脑干反应 (ABR) 的特征。图 S9. 通过基因编辑在 Kcnq4 W276S/+ 小鼠中实现 sgRNA 依赖性听力恢复。图 S10。 Kcnq4 W276S/+ 体内基因编辑的长期影响。图 S11。核糖核苷酸复合物 (RNP) 载体的优化和体内表型拯救。图 S12。体内基因编辑对 Kcnq4 W276S/+ 小鼠毛细胞和神经丝的影响。图 S13。体内基因编辑对 Kcnq4 W276S/+ 小鼠神经元存活和毛细胞形态的影响。注 S1。双 AAV 质粒系统的编码序列。电影 S1 的标题。使用铊敏感染料 (FluxOR- Tl +) 在野生型耳蜗的尖转 (6 kHz) 中对外毛细胞进行离体成像。
两种紧凑型 Cas9 直系同源物胞嘧啶碱基编辑器扩大了 DNA 靶向范围以及体内外应用
基于 CRISPR/Cas9 的碱基编辑工具可实现精确的基因组安装，并为基因治疗带来巨大希望，而 Cas9 核酸酶的大尺寸、其对特定原间隔区相邻基序 (PAM) 序列的可靠性以及靶位偏好限制了碱基编辑工具的广泛应用。在这里，我们通过将胞嘧啶脱氨酶与来自 Streptococcus_gordonii_str._Challis_substr._CH1 (ancSgo-BE4) 和 Streptococcus_thermophilus_LMG_18311 (ancSth1a-BE4) 的两个紧凑的密码子优化的 Cas9 直系同源物融合来生成两个胞嘧啶碱基编辑器 (CBE)，它们比化脓性链球菌 (SpCas9) 小得多，分别识别 NNAAAG 和 NHGYRAA PAM 序列。这两种 CBE 在胞嘧啶碱基编辑中都表现出高活性、高保真度、不同的编辑窗口和低副产物，并且在哺乳动物细胞中 DNA 和 RNA 脱靶活性极小。此外，在我们测试的靶位点上，这两种编辑器都表现出与两种基于 SpCas9 工程变体（SpCas9-NG 和 SpRY）的 CBE 相当或更高的编辑效率，它们与 ancSgo-BE4 或 ancSth1a-BE4 的 PAM 序列完美匹配。此外，我们通过 ancSgo-BE4 和 ancSth1a-BE4 成功生成了两种在 Ar 基因处带有临床相关突变的小鼠模型，它们在创始小鼠中表现出雄激素不敏感综合征和/或发育致死性。因此，这两种新型 CBE 拓宽了碱基编辑工具包，分别扩大了靶向范围和窗口，以实现有效的基因修饰和应用。
植物における相同组换えを介した精密ゲノム编集...
CRISPR/CAS系统被发现是一种细菌免疫机制（一种驱除外毒病毒等的机制），而CRISPR/CAS9（近年来一直在世界上使用最广泛的CRISPR/CAS9）来自链球菌为增生链球菌（SPCAS9）。该系统由CAS9，一种裂解双链DNA的酶（内切酶）和一个称为“ Guide RNA（GRNA）”的短RNA分子组成。 GRNA由一个20碱基的序列互补，与位于5'端的目标序列和作为CAS9的支架的序列，当Cas9与脚手架序列结合时，形成了Cas9-grna络合物。为了使CAS9识别目标序列，需要一个称为原始的基序（PAM）的特定序列，将序列与GRNA的5'末端的20个基部互补（在SPCAS9的情况下为NGG），并且需要Cas9-guide RNA与指导rna + p Douplence rebs crement cremence extrent crement crement crements extrest rebists的互补序列的位置结合的位置。 CRISPR/CAS9系统不仅用于切割DNA，而且通过将各种效应子与Cas9蛋白相结合，而CAS9蛋白的DNA裂解活性部分或完全不足，而不需要DNA双链断裂的基因组编辑技术是一个接一个地开发的。 One of these is a technology called Prime editing, in which a fusion protein in which reverse transcriptase is linked to a Cas9 (nickase-type Cas9, nCas9) protein that has partially deficient in DNA cleavage activity and an RNA molecule in which a sequence that forms the template for reverse transcriptase is linked to the 3' end of gRNA, allowing an arbitrary modification to the target gene using RNA as a template.
利用链球菌进行体内多重基因靶向...
胰腺导管腺癌是一种致命的癌症类型，与体细胞中的多种基因突变有关。基因工程小鼠几乎不适用于开发胰腺癌模型，异种移植模型在反映早期胰腺癌方面存在局限性。因此，使用成簇的规律间隔的短回文重复序列进行体内体细胞基因工程用于生成胰腺癌动物模型越来越受到关注。在本研究中，我们选择了 Kras、Trp53、Ink4a、Smad4 和 Brca2 作为靶基因，并应用空肠弯曲菌 Cas9 (CjCas9) 和化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 通过腺相关病毒 (AAV) 转导来开发胰腺癌。在确认 AAV2 的多灶性和弥漫性转导后，我们生成了 SpCas9 过表达小鼠，该小鼠在两次 AAV 转导后表现出靶基因中高双链 DNA 断裂 (DSB) 和胰腺上皮内瘤变 (PanIN) 病变；然而，三次 AAV 转导的野生型 (WT) 小鼠没有出现 PanIN。此外，将小型 Cjcas9 应用于具有两个 AAV 系统的 WT 小鼠，该小鼠还出现了高广泛性 DSB 和 PanIN 病变。观察到了导管和胰岛细胞中的组织学变化和癌症标志物（如 Ki67、细胞角蛋白、Mucin5a、α 平滑肌肌动蛋白）的表达。此外，研究还揭示了几个发现，例如 1) AAV-CjCas9 的多重 DSB 潜力、2) 导管周围淋巴细胞浸润、3) 多灶性癌症标志物表达，以及 4) 在 AAV 介导的靶向中启动 PanIN 需要 12 个月以上。在这项研究中，我们提出了一种用于体内癌症建模的有用工具，该工具也适用于其他疾病模型。
利用原生质体再生对四倍体番茄进行无 DNA CRISPR-Cas9 基因编辑
C-SL、Y-CL、JS 和 M-CS 构思并设计了实验。C-TH 和 Y-61 HY 进行了 CRISPR-Cas9 实验。C-TH、Y-HY、Q-WC、J-JY 和 F-HW 62 进行了原生质体再生、细胞生物学、分子生物学和靶向 63 诱变实验。SL 进行了 SpCas9 纯化。Y-LW 进行了 WGS 64 文库制备和 qPCR 分析。P-XZ 和 Y-CL 进行了生物信息学 65 分析。Y-HC、C-TH、C-SL、Q-WC 和 F-HW 进行了病毒相关分析。C-66 TH 进行了细胞生物学。C-TH 和 S-IL 进行了嫁接。JS、M-CS、Y-CL 和 67 C-SL 在所有合著者的帮助下撰写了手稿。所有作者都阅读并 68 批准了最终手稿。69
超紧凑型 CRISPR-Cas12j2 (CasΦ) 可实现植物的基因组编辑、基因激活和表观基因组编辑
CRISPR-Cas9、-Cas12a、-Cas12b 和 -Cas13 已被用于人类和植物细胞的基因组工程（Liu et al., 2022）。然而，这些 Cas 蛋白的尺寸较大（例如 SpCas9 为 190 kDa），难以通过病毒载体递送到细胞中。开发更小的 Cas 蛋白将导致病毒载体尺寸减小，从而可以在多功能基因组工程系统中更广泛地采用。最近，在巨型噬菌体中发现了 CRISPR-Cas12j2 (Cas F) 系统，由于 Cas12j2 的尺寸较小（80 kDa），该系统发展成为超紧凑基因组编辑器（Pausch et al., 2020）。不幸的是，使用核糖核蛋白传递的拟南芥原生质体中 Cas12j2 的基因编辑效率不到百分之一（Pausch 等人，2020 年）。如果植物科学界要采用 CRISPR-Cas12j2 介导的植物基因组编辑，显然需要进一步优化该系统。
利用原生质体再生技术对野生四倍体番茄 Solanum peruvianum 进行无 DNA CRISPR-Cas9 基因编辑
*通讯作者：yalin@sinica.edu.tw † 资深作者 C.-SL、Y.-CL、JS 和 M.-CS 构思并设计了实验。C.-TH 和 Y.-HY 进行了 CRISPR-Cas9 实验。C.-TH、Y.-HY、Q.-WC、J.-JY 和 F.-HW 进行了原生质体再生、细胞生物学、分子生物学和靶向诱变实验。SL 进行了 SpCas9 纯化。Y.-LW 进行了 WGS 文库制备和 qPCR 分析。P.-XZ、T.-LW 和 Y.-CL 进行了生物信息学分析。Y.-HC、C.-TH、C.-SL、Q.-WC 和 F.-HW 进行了病毒相关分析。C.-TH 进行了细胞生物学。C.-TH 和 S.-IL 进行了嫁接。 JS、M.-CS、Y.-CL 和 C.-SL 在所有合著者的帮助下撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终稿件。根据作者须知 (https://academic.oup.com/plphys/pages/General-Instructions ) 中所述的政策，负责分发与本文所述研究结果相关的材料的作者是 Yao-Cheng Lin (yalin@sinica.edu.tw)。
通过低温恢复实现高效的 CRISPR-Cas12f1 介导的多重细菌基因组编辑
CRISPR-Cas 系统是原核生物的一种免疫机制，可特异性识别和降解外源核酸，从基因上保护生物体 [1]。CRISPR-Cas 系统的功能分为用于靶核酸识别的向导 RNA (gRNA) 和用于切割的 Cas 核酸酶 [1]。该模块化系统通过修改 gRNA 上的靶标识别序列 (TRS) 来切割所需的核苷酸序列 [2]，从而实现跨各种生物体（包括微生物）的基因组编辑 [3, 4]。第 2 类 CRISPR-Cas 系统具有单个效应蛋白，主要用于基因组编辑。值得注意的是，大量研究集中在源自化脓性链球菌 (SpCas9) 的 Cas9 [5]。然而，Cas9 蛋白的异源表达可能导致细胞毒性或异常生长 [6, 7]。因此，内源性 CRISPR-Cas 系统 [8]、Cas9 直系同源物 [9] 和 Cas12 或 Cas13 [10] 被用作编辑工具，以提供与靶细胞更好的兼容性。此外，广泛使用的 SpCas9 的尺寸较大（4.1 kb；1,368 aa），这带来了挑战，特别是在包装到空间有限的病毒载体中时 [11]。微型 CRISPR-Cas12f1 系统因其解决这一挑战的潜力而备受关注。Cas12f1 直系同源物由约 500 aa 的单个多肽组成，这比 Cas9 的长度短得多 [12]。已知 Cas12f1 核酸酶形成二聚体，每个单个 RuvC 结构域切割靶 DNA 的两条链 [13, 14]。 Cas12f1 核酸酶在基因组中用于单基因编辑已被报道在多种生物体中，包括大肠杆菌 [15, 16]、炭疽芽孢杆菌 [17]、肺炎克雷伯菌 [18]、小鼠 [19] 和人类 [20, 21]。最近，在天蓝色链霉菌中证实了 Cas12f1 介导的两个基因同时缺失 [22]。然而，Cas12f1 在精确的多重基因组编辑中的应用尚未有记录。在本研究中，我们尝试使用 CRISPR-Cas12f1 系统在大肠杆菌中进行单核苷酸水平的多重基因组编辑。采用了两种策略——调节细胞恢复温度和修改 gRNA，并评估了它们对多重基因组编辑效率和准确性的影响。
花青素辅助农杆菌浸润用于快速评估多种植物物种的基因组编辑效率
摘要：基于 CRISPR 的基因组编辑技术继续推动生命科学的重大进步。实现基因组编辑在植物和农业中广泛应用的主要挑战是建立能够使用瞬态方法快速、全面和精确评估编辑技术的方法。在这里，我们报告了一种使用农杆菌浸润技术的新型快速基因组编辑评估方法，可以对基因组编辑效率进行广谱、简单和精确的评估。我们采用了花青素标记物来促进对基因组编辑细胞的视觉筛选，以用于成年草莓果实以及番茄果实、棉花叶和甜菜叶。使用这种方法，我们展示了快速测量由 SpCas9、LbCas12a、A3A-PBE、ABE8e 和 PPE 介导的基因组编辑效率的能力。这种新方法将使研究人员能够快速轻松地评估广泛植物物种的基因组编辑工具，从而进一步加快基因组编辑农作物的开发。