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利用 All-in-One 和 HITI CRISPR 技术在中国仓鼠卵巢细胞系中进行多重基因组编辑
简介 在哺乳动物细胞系中产生有利的基因组特征是基因功能研究极为宝贵的策略之一。1,2 基因组编辑主要通过使用传统方法进行，例如 RNA 干扰 3,4 和同源重组。然而，除了染色体 DNA 的自发裂解之外，所需突变体的频率低和特异性低导致了位点特异性核酸酶的发明。最近，成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关 (Cas) 系统为在特定基因组位点快速有效地进行基因编辑打开了一扇有希望的窗口。5,6 CRISPR/Cas9 系统由两个组件组成：向导 RNA (gRNA) 和 Cas9 蛋白。Cas9 蛋白的核酸酶活性可在任何被 gRNA 识别的基因组区域中诱导 DNA 双链断裂 (DSB)。该 gRNA 必须伴随目标基因座中相邻的原间隔基序 (PAM) 序列。7,8 NGG 是化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 的 PAM 序列，是最
评估脱靶和靶评分算法并整合到向导 RNA 选择工具 CRISPOR 中。
结果：我们首次对 CRISPR/Cas9 预测进行了独立评估。为此，我们收集了八项 SpCas9 脱靶研究的数据，并将它们与流行算法预测的位点进行了比较。我们在一项实施中发现了问题，但发现基于序列的脱靶预测非常可靠，可以识别出大多数突变率高于 0.1% 的脱靶，而通过切断脱靶分数可以大大减少假阳性的数量。我们还根据可用数据集评估了靶向效率预测算法。预测与向导活性之间的相关性差异很大，尤其是对于斑马鱼。结合我们实验室的新数据，我们发现最佳靶向效率预测模型在很大程度上取决于向导 RNA 是从 U6 启动子表达还是体外转录。我们进一步证明，最佳预测可以显著减少向导筛选所花费的时间。
艾滋病新疗法
艾滋病是一种每年导致一百多万人死亡的传染病。最近，Dash 等人首次使用 CRISPR-Cas9 结合 LASER ART 在 HIV 感染的人源化小鼠中实现了功能性治愈，成功率达到三分之一。在这里，我使用理论方法设计了一种适用于人类的治疗策略，与 Dash 等人的治疗策略不同。这里介绍的实验性治疗包括注射 Env 定向整合酶缺陷型 CRISPR 基因编辑慢病毒载体（能够表达五重 gRNA）以及人源化 SpCas9 和由 T2A 连接的嘌呤霉素抗性基因，然后进行血浆/白细胞分离术和注射免疫抑制混合物，然后进行体内正向选择。我的方案如果通过临床试验得到证实，可能会对艾滋病毒感染者产生重大影响，并且有可能成为治疗艾滋病的参考方案，尽管目前它还处于假设和理论阶段。
基于 CRISPR 的基因组编辑器的药物输送系统
成熟和新兴的基因编辑器 CRISPR–Cas 系统是一种广泛存在的原核生物防御系统，用于防御入侵的噬菌体和外来遗传物质。在自然界中，它们由 (1) 效应模块（在第 1 类 CRISPR 系统中是蛋白质复合物，在第 2 类 CRISPR 系统中是单个效应子）和 (2) 适应模块（将外来序列整合到 CRISPR 阵列中，crRNA 从中表达）组成。由于这些系统是 RNA 引导的，因此可以通过改变 crRNA 的序列重新定位它们，这为可编程基因组编辑工具提供了一个起点，有关此类工具的开发已在其他地方进行了综述 5 – 13 。第一个被设计用于人类细胞的系统是 2 类 CRISPR–Cas9 系统 14、15，其中化脓性链球菌 CRISPR–Cas9 系统 (SpCas9；也简称为 Cas9) 是目前使用最广泛的系统。Cas9 在与向导 RNA（对于 Cas9 来说称为单向导 RNA (sgRNA)）互补的靶位点处产生双链断裂 (DSB)；在人类细胞中，这些 DSB 可以通过非同源末端连接 (NHEJ) 修复，这一过程通常会导致基因功能丧失。早期临床数据 16 表明，NHEJ 介导的基因敲除会降低致病蛋白的表达（见相关链接）。靶向的 DSB 也可以通过宿主细胞的内源性同源修复机制进行修复，从而整合由 Cas9 和 gRNA 随附的外源提供的模板 DNA。 Cas9 已被改造以实现其他基因组结果。通过突变 SpCas9 的催化残基（参考文献 17），Cas9 可以转化为可编程的 DNA 结合蛋白，通常称为死 Cas9 (dCas9)。尽管单独使用 dCas9 可以通过阻止 RNA 聚合酶的通过来减少靶基因转录，但 dCas9 与转录抑制因子（例如 Krüppel 相关框结构域 18）或表观基因组修饰因子（例如 DNA 甲基化酶 DNMT3A 19、20）的融合已促成 CRISPR 干扰系统的产生。类似地，dCas9 可通过融合转录激活因子（如 VP64（参考文献 21））或表观基因组修饰因子（如人类乙酰转移酶 p300（参考文献 22）或 TET1 脱甲基酶 19、23）用于靶向转录激活。
AAV5 CRISPR-CAS9的aav5支持小鼠肺气道中的有效基因组编辑
肺中的基因组编辑具有提供治疗蛋白的长期表达以治疗肺遗传疾病的潜力。虽然将CRISPR的有效输送到肺部仍然是一个挑战。NIH体细胞基因组编辑（SCGE）con-正在开发用于疾病组织中基因组编辑的安全有效方法。由财团成员开发的方法由SCGE小型测试中心独立验证，以建立严格和可重复性。我们已经开发了并验证了双重腺相关病毒（AAV）CRISPR平台，该病毒支持了小鼠肺气道中Lox-Stop-Stop-Stop-lox-Tomato Reporter的有效编辑。在进行AAV血清型5（AAV5）的分型链球菌Cas9（SPCAS9）和单个指南RNA（SGRNA）后，我们观察到19％ - 26％的番茄阳性细胞，包括俱乐部和纤毛粘性的上皮细胞类型。这个高效的AAV输送平台将有助于研究肺部和其他组织类型中的治疗基因组编辑。
花青素辅助农杆菌浸润用于快速评估多种植物物种的基因组编辑效率
摘要：基于 CRISPR 的基因组编辑技术继续推动生命科学的重大进步。实现基因组编辑在植物和农业中的广泛应用的主要挑战是建立能够使用瞬态方法快速、全面和精确地评估编辑技术的方法。在这里，我们报告了一种使用农杆菌浸润技术的新型快速基因组编辑评估方法，可以对基因组编辑效率进行广谱、简单和精确的评估。我们使用花青素标记来促进基因组编辑细胞的视觉筛选，以用于成年草莓果实以及番茄果实、棉花叶和甜菜叶。使用这种方法，我们展示了快速测量 SpCas9、LbCas12a、A3A-PBE、ABE8e 和 PPE 介导的基因组编辑效率的能力。这种新方法将使研究人员能够快速轻松地评估广泛植物物种的基因组编辑工具，从而进一步加快基因组编辑农作物的开发。
引文：Fan, R., Chai, Z., Xing, S., Chen, K., Qiu, F., Chai, T., Qiu, JL, Zhang, Z., Zhang, H., and Gao, C. (2020). 缩短 sgRNA-DNA 介
2018 ；Chen 等人，2017 ；Kleinstiver 等人，2016 ；Lee 等人，2018 ；Slaymaker 等人，2016）。增加和减少 sgRNA-DNA 界面的长度都会显著降低五种 Cas9 变体中的四种的编辑效率，Sniper-Cas9 是个例外（Lee et al., 2018）。但这种影响的基础尚不清楚。最近，Fu 等人观察到与靶标存在大量错配的 sgRNA 能够引导 SpCas9 切口双链 DNA（Fu et al., 2019）。同样，Szczelkun 等人描述了截短的 sgRNA（互补区为 ∆ 7 nt）与嗜热链球菌 Cas9 (StCas9) 结合导致缺口分子的积累 ( Szczelkun 等人，2014 )。这些观察结果表明，截短/延长的间隔区衍生片段对核酸酶的 HNH 和 RuvC 切割域施加了不同程度的影响，使得它们在某些情况下会切开目标 DNA，而不是将其切割。在这里，我们试图检验这一假设。
一种工程化的 Cas12i 核酸酶，是动物和植物中有效的基因组编辑工具
VI 型 CRISPR-Cas 系统在基因组编辑方面越来越有吸引力。然而，该系统的天然核酸酶通常效率低下，限制了它们的应用。在这里，我们使用结构引导的合理设计和蛋白质工程来优化一种未表征的 Cas12i 核酸酶 Cas12i3。结果，我们开发了 Cas-SF01，这是一种 Cas12i3 变体，在哺乳动物细胞中表现出显著改善的基因编辑活性。与 SpCas9 和其他 Cas12 核酸酶相比，Cas-SF01 显示出相当或更优异的编辑性能。与天然 Cas12i3 相比，Cas-SF01 具有扩展的 PAM 范围，并能有效识别 NTTN 和非规范 NATN 和 TTVN PAM。此外，我们还发现了一种氨基酸替代物 D876R，它显著降低了脱靶效应，同时保持了较高的靶向活性，从而开发出了 Cas-SF01 HiFi（高保真 Cas-SF01）。最后，我们表明 Cas-SF01 在小鼠和植物中具有较高的基因编辑活性。我们的结果表明，Cas-SF01 可以作为一种强大的基因编辑平台，具有高效性和特异性，适用于各种生物体的基因组编辑应用。
优化 ABE 和 gRNA 以纠正 PiZ 突变……
在此工作过程中，腺嘌呤碱基编辑器被设计来纠正 SERPINA1 中致病的 PiZ 突变。由于关注点狭窄，优化的碱基编辑器不符合对 TadA* 脱氨酶变体或 spCas9 PAM 变体 3,4,5 的更一般建议。虽然精确纠正 PiZ 突变是最常见的编辑结果，但第二丰富的等位基因 (D341G A1AT) 表现出与野生型相当的分泌和弹性蛋白酶抑制特性。使用 LNP 递送技术，我们在 NSG-PiZ 转基因小鼠模型中评估了我们的碱基编辑方法。我们观察到平均 7 天时有益等位基因为 16.9%，3 个月时为 28.8%，此时接受治疗的动物血清 A1AT 水平相对于对照动物增加了 4.9 倍。弹性蛋白酶抑制能力的提高和单个 A1AT 亚型的质谱定量进一步证实了这一结果。肝脏病理也显著改善，测量结果显示 PAS-D 染色的 PiZ 小球减少。这些结果表明碱基编辑有可能解决 A1AT 缺乏症引起的肺病和肝病。
AAVpro® CRISPR/SaCas9 系统用户手册
I. 简介 AAVpro CRISPR/SaCas9 系统用于制备腺相关病毒 (AAV) 载体，以将编码 CRISPR/SaCas9 介导的基因组编辑所需成分的基因 [即单向导 RNA (sgRNA) 和 SaCas9 核酸酶] 递送至哺乳动物细胞。这种基于 AAV 的单载体系统使用来自金黄色葡萄球菌的 Cas9 (SaCas9)，其编辑效果与更常用的化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 相似，但短约 1 kb。通过使用较小的 SaCas9，可以将 SaCas9 和 sgRNA 序列装入单个载体中，并在体外和体内对多种哺乳动物细胞实现有效的基因组修饰。 AAVpro CRISPR/SaCas9 无辅助系统 (AAV2)（货号 632619）是一个完整的系统，包含用于构建定制设计的 sgRNA 表达质粒和制备 AAV 颗粒的试剂。AAVpro CRISPR/SaCas9 载体系统（货号 632618）包含与货号 632619 相同的组件（包装系统除外）；详细信息在第 II 部分“组件列表”中列出。