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World File Search SystemSpCAS9
使用 AAV 介导的原位基因标记可视化哺乳动物大脑中的 Arc 蛋白动力学和定位
活性调节的细胞骨架相关 (Arc) 蛋白对于突触可塑性和记忆形成至关重要。Arc 基因含有结构 GAG 逆转录转座子序列的残余，它产生的蛋白质可自组装成含有 Arc mRNA 的衣壳状结构。从神经元释放的 Arc 衣壳已被提议作为一种新的 mRNA 传递细胞间机制。尽管如此，仍然缺乏 Arc 在哺乳动物大脑中细胞间运输的证据。为了能够在体内追踪来自单个神经元的 Arc 分子，我们设计了一种腺相关病毒 (AAV) 介导的方法，使用 CRISPR/Cas9 同源独立靶向整合 (HITI) 将荧光报告基因标记到小鼠 Arc 蛋白的 N 端。我们表明，编码 mCherry 的序列可以成功敲入 Arc 开放阅读框的 5′ 端。虽然 Arc 起始密码子周围有 9 个 spCas9 基因编辑位点，但编辑的准确性高度依赖于序列，只有一个靶标导致框内报告基因整合。在海马中诱导长期增强 (LTP) 时，我们观察到 Arc 蛋白的增加与荧光强度和 mCherry 阳性细胞数量的增加高度相关。通过邻近连接分析 (PLA)，我们证明 mCherry-Arc 融合蛋白通过与突触后棘中的跨膜蛋白 stargazin 相互作用而保留了 Arc 功能。最后，我们在靠近编辑神经元的 mCherry 阳性棘的 mCherry 阴性周围神经元中记录了 mCherry-Arc 与突触前蛋白 Bassoon 的相互作用。这是第一项为哺乳动物大脑中 Arc 的神经元间体内转移提供支持的研究。
使用CRISPR/SACAS9和温度耐受性LBCAS12A
摘要Nicotiana tabacum是一种非食品草药，有可能被用作生物基因生成药物，疫苗或有价值的小型代谢物。为了实现这些目标，可以改善预先设计的基因组修改的遗传工具是必不可少的。CRISPR/CAS核酸酶的发展允许诱导特定于特定的双链断裂，以增强同源重组介导的基因靶向（GT）。但是，对于包括烟草在内的许多农作物而言，GT的效率仍然是一个具有挑战性的障碍。最近，对几种植物物种的研究表明，通过用其他CRISPR/CAS基核酸酶代替SPCAS9，GT效率可能会大大增强。因此，我们测试了SACAS9以及温度不敏感的LBCAS12A（TTLBCAS12A）靶向烟草基因。同时，我们还优化了农杆菌介导的烟草转化和组织培养的方案。以这种方式，当使用TTLBCAS12A时，我们可以将GT效率提高到最高三分之一的接种子叶，而TTLBCAS12A的表现非常优于SACAS9。此外，我们可以证明GT反应的转化道长度可以长606 bp，在大多数情况下，它的长度超过250 bp。我们获得了多个可遗传的GT事件，主要是杂合的，但也是双重的GT事件，有些事件没有T-DNA集成。因此，我们不仅能够第一次获得基于CRISPR/CAS的可遗传性GT事件，而且第一次获得了TTLBCAS12A，而且我们的结果也可能是烟草中的基因编辑和GT的优越选择。
基于 MMEJ 的精准基因编辑在基因治疗和功能基因组学中的应用
基因编辑实验通常会引发容易出错的非同源末端连接，以修复 DNA 双链断裂 (DSB)。微同源介导的末端连接 (MMEJ) 可以为功能基因组和躯体治疗应用产生更可预测的结果。MENTHU 是一种计算工具，可预测可能导致斑马鱼中 MMEJ 修复的同质基因型 (PreMA) 的核酸酶靶向位点。我们在小鼠胚胎干细胞中 5,885 个不同的 Cas9 介导的 DSB 上部署了 MENTHU，并将预测与另一种 DSB 修复预测算法 inDelphi 的预测进行了比较。MENTHU 正确识别了所有可用 PreMA 中的 46%，灵敏度是 inDelphi 的两倍。我们还引入了 MENTHU@4，这是在这个大型数据集上训练的 MENTHU 更新。我们在这个更大的数据集上训练了两种基于 MENTHU 的算法，并相互验证了它们，MENTHU 和 inDelphi。最后，我们估计了脊椎动物编码区中 SpCas9 可靶向 PreMA 的频率和分布，以评估基于 MMEJ 的基因发现靶向性。54 个基因中有 44 个（81%）至少包含一个早期的框架外 PreMA，而当同时考虑 Cas12a 时，54 个基因中有 48 个（89%）也包含至少一个早期的框架外 PreMA。我们认为 MMEJ 可以大规模部署用于反向遗传学筛选，并且具有足够的基因内密度率，几乎可以用于所有基于功能丧失的基因编辑治疗应用。
通过使用 CRISPR/Cas12a 可以增强植物体内基因靶向
通过同源重组 (HR) 控制植物基因组的改变仍然很难实现。我们之前开发了植物内基因打靶 (ipGT) 技术，该技术依赖于通过双链断裂同时激活目标基因座和切除目标载体。尽管使用 SpCas9 会导致拟南芥中的 ipGT 频率较低，但我们最近能够通过使用卵细胞特异性表达强效但适用范围较广的 SaCas9 核酸酶来提高效率。在这项研究中，我们现在测试了是否可以进一步改进 ipGT，方法是在染色体内 HR 效率增强的细胞中进行，或者使用 Cas12a，这是一种具有替代切割机制的不同类型的 CRISPR/Cas 核酸酶。我们之前可以证明植物具有三种 DNA ATPase 复合物，如果因突变而丢失，它们都会导致同源基因组重复不稳定性。由于这些蛋白质以独立途径发挥作用，我们在双突变体中测试了 ipGT，其中染色体内 HR 增强了 20 至 80 倍。然而，我们无法获得更高的 ipGT 频率，这表明基因靶向 (GT) 和染色体重复诱导 HR 的机制不同。然而，使用 LbCas12a，尽管非同源末端连接 (NHEJ) 诱导效率较低，但 GT 频率高于 SaCas9，表明 Cas12a 特别适合诱导 HR。由于 SaCas9 因其较长的富含 GC 的 PAM 序列而受到很大限制，因此使用富含 AT 的 PAM 的 LbCas12a 可以大大拓宽 ipGT 的范围，尤其是在靶向启动子和内含子等 CG 沙漠时。
段东升的出版物 书籍 2024
• Zhang D、Hurst T、Duan D、Chen SJ。统一能量学分析揭示SpCas9 切割活性以实现最佳 gRNA 设计。美国国家科学院院刊，116(18):8693- 8698。2019 年。• Wasala NB、Hakim CH、Chen SJ、Yang NN、Duan D。在犬类杜氏肌营养不良症模型中开展的首个 CRISPR 编辑研究解答了哪些问题，以及尚未解答哪些问题。人类基因治疗，30(5):535-543。2019 年。• Patel A、Zhao J、Duan D、Lai Y。设计用于递送大量或多个转基因的 AAV 载体。分子生物学方法，1950:19-33。，2019 年 • Nance ME、Duan D。开发下一代肌肉基因治疗载体。肌肉基因治疗第 2 版（出版商：Springer。）Duan D 和 Mendel JR（编辑），印刷中，2019 年。• Duan D. 关于临床前肌肉基因治疗研究的注意事项。肌肉基因治疗第 2 版（出版商：Springer。）Duan D 和 Mendel JR（编辑），印刷中，2019 年。• Lai Y，Duan D。肌肉基因治疗表达盒的设计。肌肉基因治疗第 2 版（出版商：Springer。）Duan D 和 Mendel JR（编辑），印刷中，2019 年。• Wasala LP、Hakim CH、Yue Y、Yang NN、Duan D。腺相关病毒载体在小鼠和狗中的系统性递送。分子生物学方法 1937:281-294，2019 年。
揭示CRISPR/ ... div>的精确维修动态
图1。UMI-DSBSEQ定量单分子测序DSB和修复产品在番茄中的三个靶标。a）时间课的收集：叶肉细胞原生质体是从2-3周大的M82 Solanum Lycopersicum的幼苗中分离出来的。重复的样品在72小时内为72个时间点中的每一个中的每一个制备了200,000个原生质体。CRISPR RNP由PEG介导的转换引入。在提取RNP引入和DNA后，在0、6、12、24、36、48和72小时将样品冷冻。b）UMI-DSBSEQ目标设计：特定于目标序列的引物，与SGRNA目标序列两侧的限制酶位点结合，以创建完整分子（WT或Indel）的可用端，以连接适配器。c）UMI-DSB文库制备：从时间探索收集中提取DNA，其中包含WT（1），未经修复的DSB（2）和包含Indels（3）的完整分子，在体外受到限制，限制了确定目标切割位点的限制酶。通过填充和a添加的最终修复后，由P7 Illumina流量细胞序列和包含i7索引和9BP唯一分子标识符（UMIS）组成的Y形适配器（UMIS）与未经修复的DSB和受限端相连。通过连接介导的PCR进行的靶标特异性扩增，其中一个引物与适配器序列相同，并包含P7 Illumina Tail（橙色）和一个针对靶序列（蓝色）的引物（橙色），带有P5 Illumina Tail（红色）。这会导致SPCAS9切位点和底漆之间的DSB的单端扩增。红色X表示DSB的未捕获端。
利用“全内”技术在肝细胞中进行离体/体内基因编辑...
肝脏是细胞和基因治疗以及基因编辑的首选器官，因为遗传性疾病众多且常常危及生命。已证明酪氨酸血症小鼠作为模型生物的 HDR 可以纠正该疾病，尽管不诱导 DSB 的同源重组效率非常低（Paulk 等人，2010 年；Junge 等人，2018 年）。在类似的小鼠模型中，通过流体动力学 DNA 注射（Yin 等人，2014 年）和非病毒 Cas9 mRNA 与腺相关病毒 (AAV) 载体介导的 HDR 模板递送相结合（Yin 等人，2016 年）证明了 CRISPR/Cas9 介导的表型拯救。AAV 载体已成为肝脏的基因递送载体，据报道在人体临床试验中具有令人印象深刻的治疗效果（Nathwani 等人，2014 年）。最近，在一个载体上编码化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 表达盒，在另一个载体上编码引导 RNA (gRNA) 和修复模板的双 AAV 载体系统的应用，逆转了新生小鼠鸟氨酸转氨甲酰酶基因的突变 ( Yang et al., 2016 )。这种体内基因编辑工具在两个载体上的分段归因于 AAV 的拟议包装尺寸限制，即 4.9 kb ( Grieger and Samulski, 2005 ) 至 5 kb ( Wu et al., 2010 )。两种不同的 AAV 载体共同递送是可行的，每种载体编码所需成分的一部分，这些成分在细胞内通过转剪、同源重组或内含肽重新结合（ Truong 等人， 2015 ），但在体内发生率较低（ Xu 等人， 2004 ）。
CRISPR-Cas9 介导诱导人类支气管上皮细胞发生大型染色体倒位
1. 通过 UCSC 基因组浏览器 ( https://genome.ucsc.edu/ ) 可获得用于设计两个 gRNA 的目标 DNA 序列。a. 选择感兴趣的基因组版本。在我们的例子中，使用的是“人类 GRCh38/hg38”。b. 根据已知的倒位断点 1 的位置，标记断点前 100-150 bp 到断点后 100–150 bp 范围内的基因组区域。例如，如果断点 1 位于 chr3:2,920,305，则在 UCSC 基因组浏览器搜索框中输入“chr3:2,920,205–2,920,405”以标记所需的染色体区域，然后单击“Go”。c. 在 UCSC 基因组浏览器工具栏上选择“查看”，然后单击“DNA”选项。d.在新窗口中，单击“获取 DNA”以获得准确的 DNA 序列。这是使用 CRISPOR 算法设计 gRNA 引物所需的序列（见下面的步骤 2a）。e. 对倒位的断点 2 重复步骤 1a-1d。2. 要设计 gRNA，请使用 CRISPOR 算法（http://crispor.tefor.net/）：a. 输入从步骤 1d 获得的断点 1 的 DNA 序列。确保参考基因组与 UCSC 浏览器（步骤 1a）中使用的基因组相匹配，然后选择可通过转染载体编码的 Cas9 酶类型识别的 Protospacer Adjacent Motif (PAM)。如果转染载体表达 SpCas9，则选择 20 bp-NGG PAM 格式。单击“提交”以获得针对模板 DNA 的候选 gRNA 序列。b. CRISPOR 算法默认按特异性从高到低对候选 gRNA 序列进行排序，因为这是关键参数。从新页面上出现的候选 gRNA 列表中，选择具有最高麻省理工学院 (MIT) 和切割频率确定 (CFD) 特异性得分的指导序列（Doench 等人，2016 年；Hsu 等人，2013 年；Tycko 等人，2019 年）。这些分数根据以下方面评估候选 gRNA
CAS9的组织特异性表达对整体没有影响...
目标：CRISPR/CAS9技术彻底改变了基因编辑，并快速跟踪了我们为研究和治疗应用的利益操纵感兴趣的基因的能力。虽然许多进步已经并且继续在该地区取得了成功，但迄今为止，最受使用的技术可能是敲除细胞，组织和动物的产生。这项技术的优点是许多折叠，但是关于外蛋白（例如Cas9）对哺乳动物细胞功能的长期表达的影响仍然存在一些问题。几项研究提出，CAS9的慢性过表达（无论是否伴随其伴随的指南RNA）可能会对细胞功能和健康产生有害影响。在体内应用这项技术时，这是特别关注的问题，其中Cas9在感兴趣的组织中的慢性表达可能会促进类似疾病的表型，从而使对感兴趣基因效应的研究混淆。尽管这些担忧仍然有效，但尚无对我们知识的研究直接证明这一点。方法：在这项研究中，我们使用了Lox-Stop-lox（LSL）SPCAS9 ROSA26转基因（TG）小鼠系列来生成四种组织特异性CAS9-TG模型，这些模型在心脏，肝脏，骨骼肌或脂肪组织中表达Cas9。，我们对这些小鼠进行了全面的表型，直到20周龄，随后对其器官进行了分子分析。2021作者。由Elsevier GmbH出版。这是CC BY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）下的开放访问文章。结果：我们证明CAS9在这些组织中的表达对动物的全身健康没有不利影响，也没有诱导组织对全身能量代谢，肝脏健康，炎症，纤维化，纤维化，心脏功能或肌肉质量的任何特异性影响。结论：我们的数据表明，这些模型适合使用LSL-CAS9-TG模型研究基因缺失的组织特异性效应，并且使用这些模型观察到的表型可以用来构成基因，并且不能被基因特异性解释，而不是由Cas9 cas9的慢性过表达的混淆。
CRISPR 人工剪接因子。
剪接是去除前 mRNA 片段（称为内含子）同时将片段（称为外显子）连接在一起形成成熟 mRNA 的过程 1 。可变剪接是一种现象，其中基因的不同外显子片段剪接在一起形成具有不同序列的成熟 mRNA，大大扩展了单个基因编码的蛋白质库。可变剪接过程深深嵌入基因调控网络中，并控制 90% 以上的人类基因的基因异构体表达 2 。鉴于其普遍性，RNA 剪接失调与许多疾病有关也就不足为奇了 3 – 5 。RNA 测序是一种强大的工具，可用于“读取”转录组并识别不同细胞类型、条件和疾病中可变剪接的变化 2、5、6。但是，缺乏一种可扩展的工具来精确且可逆地“编写”可变剪接。尽管针对特定基因异构体进行降解的异构体特异性 RNAi 或异构体特异性 cDNA 过表达可用于扰乱异构体水平 7、8，但可能无法保持靶基因的整体表达水平。虽然剪接转换反义寡核苷酸 (ASO) 可有效扰乱剪接，甚至已进入临床试验 9，但它们的成本对于大规模研究而言过高，并且需要筛选许多设计以确定有效的靶序列。此外，由于 ASO 本质上是瞬时的，因此它们不适用于需要稳定或可诱导表达的用例。RNA 调节蛋白与异源 RNA 结合结构域的融合，例如 Pumilio/PUF、MS2 外壳蛋白 (MCP)、PP7 外壳蛋白 (PCP) 和 λ N，已经允许人工调节 RNA 过程 10 – 15。例如，通过工程化的 PUF 结构域将富含丝氨酸或富含甘氨酸的结构域束缚到外显子上，分别诱导它们的包含或排除12。然而，这些人工 RNA 效应分子需要蛋白质工程或在靶 RNA 中插入人工标签，并且依赖于短识别序列，这限制了靶向灵活性和特异性。遗传学和表观遗传学领域极大地受益于基于 RNA 引导的 DNA 靶向 CRISPR-Cas 系统的技术的爆炸式增长 16。我们，以及其他一些人，已经成功地实施了分子工具来修改目标 DNA 位点的遗传序列或表观遗传状态 17-25。CRISPR 介导的 DNA 水平基因编辑方法已被用于扰乱剪接（在剪接位点进行碱基编辑/插入缺失或切除整个外显子）19-21。然而，由于共享同一 DNA 片段的 DNA 顺式调控元件（例如转录因子结合位点）可能受到干扰，因此这些方法可能会产生混淆效应。此外，使用 CRISPR 介导的 DNA 缺失或突变方法很难促进外显子的插入。首次证明了使用 CRISPR 靶向 RNA 的激动人心的前景，即将最常用的 DNA 靶向 SpCas9 转化为 RNA 核酸酶“ RCas9 ”，并添加了 PAMmer - 一种寡核苷酸，当与靶 RNA 结合时，会模拟 SpCas9 结合所需的原型间隔区相邻基序 (PAM) 19 。虽然将 RCas9 靶向重复序列不需要 PAMmer 26 ，但重复序列仅占所有 RNA 顺式调控元件的一小部分。继 RCas9 首次报道之后，其他 CRISPR/Cas9 系统也被发现可在体外与单链 RNA 结合 27 、 28 ，但缺乏它们在哺乳动物细胞中体内 RNA 结合的证据。最近发现了来自细菌 CRISPR 系统的 RNA 引导的 RNA 核酸酶 29 – 31 。它们对哺乳动物细胞的适应不仅允许可编程的 RNA 降解 29、31、32，而且还可用于设计新功能，例如 RNA 序列编辑 30、活细胞 RNA 成像 32 和诊断 33。特别是，CasRx 是从 Ruminococcus flavefaciens 中分离出来的最近鉴定出的 IV-D 型 CRISPR-Cas 核糖核酸酶