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Cas9 的组织特异性表达对整体没有影响......
目标：CRISPR/Cas9 技术彻底改变了基因编辑，并加快了我们操纵目标基因的能力，以造福研究和治疗应用。尽管该领域已经取得了许多进展，并且还在继续取得进展，但迄今为止使用最广泛的技术可能是产生敲除细胞、组织和动物。该技术的优势是多方面的，但关于长期表达 Cas9 等外来蛋白质对哺乳动物细胞功能的影响，仍然存在一些问题。几项研究表明，Cas9 的慢性过度表达（无论是否伴有其伴随的向导 RNA）可能会对细胞功能和健康产生有害影响。在体内应用该技术时，这一点尤其令人担忧，因为 Cas9 在目标组织中的慢性表达可能会促进疾病样表型，从而混淆对目标基因影响的研究。尽管这些担忧仍然存在，但据我们所知，尚无任何研究直接证明这一点。方法：在本研究中，我们使用 lox-stop-lox (LSL) spCas9 ROSA26 转基因 (Tg) 小鼠系生成了四种组织特异性 Cas9-Tg 模型，这些模型在心脏、肝脏、骨骼肌或脂肪组织中表达 Cas9。我们对这些小鼠进行了全面的表型分析，直至 20 周龄，随后对其器官进行了分子分析。结果：我们证明 Cas9 在这些组织中的表达对动物的全身健康没有不利影响，也不会对全身能量代谢、肝脏健康、炎症、纤维化、心脏功能或肌肉质量产生任何组织特异性影响。结论：我们的数据表明，这些模型适用于使用 LSL-Cas9-Tg 模型研究基因缺失的组织特异性效应，并且利用这些模型观察到的表型可以自信地解释为基因特异性的，并且不会因 Cas9 的慢性过表达而混淆。2021 作者。由 Elsevier GmbH 出版。这是一篇根据 CC BY-NC-ND 许可协议开放获取的文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。
利用 CRISPR‐FrCas9 系统靶向回文 TA 位点扩大植物基因组编辑范围和概况
摘要 CRISPR-Cas9 被广泛用于基因组编辑，但其 PAM 序列要求限制了其效率。在本研究中，我们探索了 Faecalibaculum rodentium Cas9 (FrCas9) 用于植物基因组编辑，尤其是水稻。FrCas9 识别简洁的 5 0 -NNTA-3 0 PAM，与最流行的 SpCas9 的 5 0 -NGG-3 0 PAM 位点相比，它靶向植物基因组中更丰富的回文 TA 位点。FrCas9 在所有测试的 5 0 -NNTA-3 0 PAM 位点处均显示出切割活性，编辑结果与典型的 CRISPR-Cas9 系统具有相同的特征。FrCas9 在稳定的水稻品系中诱导高效靶向诱变，容易产生具有预期表型的双等位基因突变体。我们通过与核酸外切酶 TREX2 融合增强了 FrCas9 产生更大缺失的能力。 TREX2-FrCas9 产生的缺失比 FrCas9 大得多，且不会影响编辑效率。我们证明了 TREX2-FrCas9 是一种有效的 microRNA 基因敲除工具。此外，我们还开发了 FrCas9 衍生的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 和腺嘌呤碱基编辑器 (ABE)，用于在水稻植物中进行 C 到 T 和 A 到 G 的靶向碱基编辑。基于全基因组测序的脱靶分析表明 FrCas9 是一种高度特异性的核酸酶。然而，TREX2-FrCas9 在植物中的表达会导致可检测到的不依赖向导 RNA 的脱靶突变，主要是单核苷酸变体 (SNV)。我们共同建立了一种有效的 CRISPR-FrCas9 系统，用于在植物中进行靶向诱变、大量缺失、C 到 T 碱基编辑和 A 到 G 碱基编辑。 PAM 中的简单回文 TA 基序使 CRISPR-FrCas9 系统成为一种有前途的植物基因组编辑工具，具有扩大的靶向范围。
干细胞研究
SPG11 中的双等位基因致病变异编码了 spatacsin，可导致罕见的运动神经元疾病，如遗传性痉挛性截瘫 11 型 (SPG11-HSP)、夏科-马里-图斯病和青少年型肌萎缩侧索硬化症-5 (ALS5)。SPG11-HSP 是最常见的复杂常染色体隐性 HSP。除了下肢痉挛和截瘫外，SPG11-HSP 患者还存在其他症状，如认知能力下降、上肢无力和周围神经病变（Pozner et al., 2020）。SPG11 编码一种 ~280 kDa 的蛋白质，称为 spatacsin，其参与自噬溶酶体机制的功能和囊泡运输。然而，由于缺乏特异性抗体，spatacsin 的确切功能尚不清楚。为了克服这一障碍，我们生成了一种内源标记的 SPG11 人诱导多能干细胞 (hiPSC) 系 (SPG11-HA)。标记是通过使用 CRISPR/Cas9 技术将具有同源定向修复的 HA 标签插入市售人类游离型 iPSC 系 (A18945；Thermo Fisher Scientific) 中进行的。用编码 SpCas9、GFP 和单个向导 RNA (gRNA；addgene) 的载体以及单链寡核苷酸 (ssODN) 供体 DNA 进行核转染。ssODN 包含一个 HA 编码区，两侧是 ~66 – 67 个核苷酸同源臂（图 1 AB）。经过单细胞分选程序和克隆扩增后，通过 PCR 扩增和桑格测序鉴定出阳性候选者（图 1 A）。通过 Sanger 和 Amplicon/NGS 测序确认了基因型 (图 1 A、C)。在预测的脱靶位点未检测到致病变异 (图 S1 A)。与未经过 CRISPR 过程的 iPSC 对照细胞 (ctrl) 相比，染色体微阵列分析未发现核转染报告系中存在任何从头拷贝数变异 (CNV) (图 1 D)。然而，在这两种细胞系中均发现了 20q11.21 处的增益。这种 CNV 在 hiPSC 和癌症中反复出现，表明它具有增殖或生存优势 (Nguyen et al., 2014)。ctrl 和 SPG11-HA iPSC 均表现出典型的多能性细胞样形态，并经支原体检测呈阴性 (图 S1 BC)。两种细胞系均表达多能性标记，并在三系分化范式测试中分化为所有三个胚层的衍生物（图 1 EF；图 S1 D；表 1）。为了验证报告细胞系的功能，通过蛋白质印迹研究了标记的 spatacsin 的表达。正如预期的那样，HA 标记的 spatacsin 在 280 kDa 的大小下可检测到（图 1 G）。由于 spatacsin 功能丧失后表现出一系列神经系统症状，因此评估了神经分化能力。近 90% 的分化对照和 SPG11-HA 神经祖细胞 (NPC) 表达
目标1：为大豆开发有效的无PAM无PAM CAS9和主要的编辑平台。这是一个基因编辑工具开发目标，可以建立UPO
目标1：为大豆开发有效的无PAM无PAM CAS9和主要的编辑平台。这是一个基因编辑工具开发目标，它基于我们先前开发的CRISPR-CAS9基因编辑平台。为大豆建造主要的编辑系统。基于SPCAS9 Nickase的两个不同变体和M-MLV的逆转录酶，已经为大豆毛的根和稳定的转化和基因组编辑制作了三个主要的编辑系统。分别使用命名为PE1，PE2和PE3的三个系统，以制造针对编码CDPK47，CDPK48，CDPK49和CDPK50的大豆基因的主要编辑构建体。PE1和PE2系统，以确定哪种最适合于创建精确的遗传变化，以改善大豆的性状。不幸的是，这两个系统无效地在毛状根中的四个CDPK基因中创建突变。因此，我们决定使用PE2系统测试其他基因FAD2和EPSP，并且再次没有发现靶基因已修改的证据。第三个Prime编辑版本，名为PE3，还测试了在毛状根部编辑FAD2和EPSP基因的能力，这也没有成功。PE1，PE2和PE3 PRIME编辑构建体在大豆中似乎不起作用，因此我们正在采用替代方法来修改向量，以使用不同的策略来生成Prime编辑指南RNA。这些结构将在下一个报告期间进行测试。总而言之，使用在其他工厂中使用的策略，在大豆中的主要编辑应用并不能有效。1。我们继续努力确定将在大豆中有效的主要编辑策略。目标2：应用基础编辑和主要编辑来修改影响大豆对干旱反应的基因。我们设计了两种不同的CRISPR-Cas9构建体来敲除CDPK基因的功能，这些功能被预测会影响大豆对干旱的反应。基于CRISPR-CAS9的基因敲除大豆CDPK家族基因（CDPK47、48、49和50）的两个CRISPR构建体（NK44和NK46）已建立，以敲除CDPK基因的两种组合。a。 NK44：PATEC-INCAS9-GCDPK49-50（靶向CDPK49和CDPK50）b。 NK46：PATEC-INCAS9-GCDPK47-50（靶向CDPK47，CDPK48，CDPK49和CDPK50）对这两种构建体进行了大豆转化，并为转染料的存在而基因型进行了基因型。我们为NK44构建体获得了四个转基因阳性植物。我们总共获得了NK46构建体的七个转基因阳性植物。种子，我们将这些种子称为T1代。至少为每条线发芽了至少24个T1幼苗，我们进行了PCR首先确定NK44或NK46构建体是遗传的，我们