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EIGC 基因组编辑工作流程目标
EIGC 成本 Synthego 成本 总成本 敲入 - 常规细胞系 转染池 $4,500 $9,250-$11,250 克隆 $10,200 $18,500-$20,500 Synthego/EIGC 合作克隆 $15,000-$17,000 敲除 - 常规细胞系 转染池 $2,800 $2,000-$4,000 克隆 $5,800 $11,400-$13,400 Synthego/EIGC 合作克隆 $5,000-$7,000
使用核转染技术利用 RNP 对人类 iPS 细胞进行 CRISPR 编辑
使用 RNA 和 RNP • 建议戴上手套并使用无核酸酶的试管和试剂，以避免 RNase 污染。 • 始终保持无菌技术，并使用无菌过滤移液器吸头。 • 所有 Synthego 和 Nucleofector™ 试剂均应根据制造商的建议储存。 • 合成的 sgRNA 应溶解在 TE 缓冲液中，并使用无核酸酶的水稀释至工作浓度。请参阅 Synthego 快速入门指南，了解溶解和储存合成 sgRNA 的最佳实践。 • RNP 可直接在 Nucleofector™ 溶液中形成。 • RNP 复合物在室温下可稳定保存长达 1 小时（可在 4°C 下保存长达一周，或在 -20°C 下保存长达 1 个月）。请注意，在 4°C 下储存的 RNP 长时间后可能会受到微生物生长的污染。
合成SGRNA套件 - Net
请访问Synthego.com/Resources找到建议的转染协议。步骤4：分析敲除效率合成的推断CRISPR编辑（ICE）是一种免费的在线工具，可简单地使用Sanger序列数据对基因组编辑进行易于定量评估。该软件比较了从编辑和未编辑的细胞库中分离出的基因组DNA产生的扩增子的序列轨迹。该工具可在Ice.synthego.com上找到。基因组DNA制备，冰分析和克隆分离的方案可在Synthego.com/resources上获得。
通过 CRISPR-Cas9 引导的腺嘌呤碱基编辑器捕获 DNA
利益竞争：加州大学董事会已获得和正在申请 CRISPR 技术专利，JAD 和 GJK 是这些技术的发明者。JAD 是 Caribou Biosciences、Editas Medicine、Scribe Therapeutics 和 Mammoth Biosciences 的联合创始人。JAD 是 Caribou Biosciences、Intellia Therapeutics、eFFECTOR Therapeutics、Scribe Therapeutics、Mammoth Biosciences、Synthego 和 Inari 的科学顾问委员会成员。JAD 是强生公司的董事，其研究项目由 Biogen 和辉瑞公司赞助。PAB 是 Beam Therapeutics 的顾问，拥有股票期权。DRL 是 Editas Medicine、Pairwise Plants、Beam Therapeutics 和 Prime Medicine 的顾问和联合创始人，这些公司使用基因组编辑技术。作者已提交了进化 ABE 的专利申请。
一个快速高效地设计多编辑工程的平台...
图 1：(A) Notch 的多重基因编辑平台使用属于 2 类 VA 型 CRISPR-Cas 家族的 MAD7 核酸酶，该核酸酶可识别富含胸腺嘧啶的 PAM ′YTTV′ 并产生双链交错断裂。(B) Notch 的符合 GMP 标准的 iPSC 系使用专有编辑协议针对临床相关基因进行批量编辑效率。我们的高通量 gRNA 筛选工作流程结合了通过 Synthego 的 CRISPR 编辑干扰 (ICE) 工具进行的可行性评估和插入缺失检测，然后通过靶向扩增子测序进行深入分析（左）。原代 T 细胞中敲除的表型验证（右）（C）与其他多重方法相比，我们的多重编辑方法实现了显着更高的编辑效率（左图）和显着降低的靶向易位率（中图）
小鼠的主要编辑揭示了单个碱基在驱动组织特异性基因表达
Pan Gao 1* , Qing Lyu 1* , Amr R. Ghanam 1* , Cicera R. Lazzarotto 2 , Gregory A. Newby 3,4,5 , Wei Zhang 1 , Mihyun Choi 6 , Orazio J. Slivano 1 , Kevin Holden 7 , John A. Walker II 7 , Anastasia P. Kadina 7 , Rob J. Munroe 8 , Christian M. Abratte 8 , John C. Schimenti 8 , David R. Liu，3,4,5 Shengdar Q. Tsai 2，Xioochun Long 1,6‡，Joseph M. Miano 1‡1医学系血管生物学中心，乔治亚州奥古斯塔大学医学院，奥古斯塔大学，乔治亚州奥古斯塔大学，乔治亚州30912； 2圣裘德儿童研究医院，孟菲斯，田纳西州38195； 3医疗保健公司变革技术研究所，马萨诸塞州剑桥大学博士和哈佛大学，马萨诸塞州02142； 4化学与化学生物学系，哈佛大学，剑桥，马萨诸塞州02138； 5霍华德·休斯医学院，哈佛大学，剑桥，马萨诸塞州02138； 6奥尔巴尼医学院，奥尔巴尼，纽约，12208； 7 Synthego Corporation，Redwood City，CA 94025； 8纽约州伊萨卡康奈尔大学生物医学科学系14853
恒河猴体内 PCSK9 腺嘌呤碱基编辑可降低 LDL 胆固醇水平
1 苏黎世大学药理学和毒理学研究所，瑞士苏黎世。2 Acuitas Therapeutics Inc.，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华。3 Oncode 研究所，马克西玛公主儿科肿瘤中心，荷兰乌得勒支。4 苏黎世功能基因组学中心，苏黎世联邦理工学院/苏黎世大学，瑞士苏黎世。5 苏黎世联邦理工学院分子健康科学研究所生物系，瑞士苏黎世。6 苏黎世大学医院和大学病理学和分子病理学系，瑞士苏黎世。7 苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系，瑞士苏黎世。8 Synthego Corporation，美国加利福尼亚州雷德伍德城。9 苏黎世大学生物化学系，瑞士苏黎世。10 苏黎世联邦理工学院基因组工程与测量实验室，瑞士苏黎世。 11 宾夕法尼亚大学医学系，美国宾夕法尼亚州费城。12 苏黎世大学儿童医院代谢与儿童研究中心分部，瑞士苏黎世。13 苏黎世综合人体生理学中心，瑞士苏黎世。14 苏黎世神经科学中心，瑞士苏黎世。15 苏黎世大学分子生命科学研究所，瑞士苏黎世。✉ 电子邮件：ssemple@acuitastx.com；schwank@pharma.uzh.ch
cv downfare
2021–present Director, Altos 2021–present Scientific Advisory Board member, The Column Group 2021–present Director, Tempus 2018–present Director, Johnson & Johnson 2018–present Editorial board member, CRISPR Journal 2014–present Member, Scientific advisory board, Welch Foundation 2014–2020 Executive Director, Innovative Genomics Institute 2012–present Member, Scientific Advisory Board, Shurl and Kay Curci Foundation 2010–present Scientific Advisory Board member for biotech companies including eFFECTOR, Therapeutics, Caribou Biosciences, Intellia, Synthego, Inari, Mammoth Biosciences, Scribe, Algen Biotechnology, and Felix Biosciences 2006–2019 Editorial board member, Molecular Cell 2003–2019 Member, Scientific Advisory Board, David & Lucile Packard Foundation 2004-审查编辑委员会成员，科学2003年 - 班级生物物理学研究生群，加州大学伯克利分校2015 - 2018年主席，主席，总理咨询委员会生物学咨询委员会，UC Berkeley 2016–2018受托人Pomona College，Pomona College，Pomona College，POMONA College，POMONA COLLECE，2006 - 2016年Editorial Coperitial Indorial Coperitial Indorial，ACS SEDITORIAL，ACS ACS COMPERITIAL 2004-2014-2014-2014 2003 - 2006年MCB研究生录取委员会成员兼主席，UCB 2000-2012受托人，Pomona College 2000-2012成员，密歇根大学生命科学学院顾问委员会成员，1998 - 2010年1998 - 2010年编辑委员会成员，分子生物学杂志成员
高效 CRISPR/Cas9/AAV 协议
1. 为了在小鼠 HSPC 中实现有效的同源重组 (HR) 事件，需要具有高编辑效率的特定单向导 RNA (sgRNA)。我们使用 CrispRGold 程序 ( https://crisprgold.mdc-berlin.de ) 来设计特定的 sgRNA 并预测潜在的脱靶 ( Chu et al., 2016a )。每个目标序列应设计几个特定的 sgRNA。必须通过使用 T7 内切酶 I 测定 ( Guschin et al., 2010 ) 测量错配的 DNA 异源双链体以及对至少 2 种主要血细胞类型（例如 B 细胞和 T 细胞）的 PCR 产物进行 Sanger 测序来验证所有 sgRNA 的编辑效率。可以从 IDT、Synthego 或其他供应商处订购化学修饰或未修饰形式的 sgRNA。 2. 供体模板的最佳设计对于小鼠 HSPC 中的高效 HR 至关重要。供体模板包括 5'、3' 同源臂和所需的修饰基因序列。同源臂的长度取决于目标序列的特异性，每个同源臂由 600 到 2000 bp 组成。AAV 基因组的包装能力是设计供体模板的一个限制，因为基于 AAV 的供体模板的最大长度不应超过 4.5kb。如果没有使用报告基因，则应通过引入可用于量化 HR 效率的沉默突变将限制性酶识别位点添加到修饰的基因序列中。3. 为了通过 PCR 扩增和测序量化目标位点中的 HR 和非同源末端连接 (NHEJ) 事件，必须在外部设计正向或反向引物，或两者
Mammoth 已经是基于 CRISPR 的疾病检测领域的领导者，最新一轮融资将推动 Mammoth 强大的平台
蛋白质发现扩展到基因编辑和治疗应用 加州南旧金山（2020 年 1 月 30 日）Mammoth Biosciences 是世界上第一个基于 CRISPR 的疾病检测平台背后的公司，今天宣布其 B 轮融资获得 4500 万美元超额认购。此次融资由德诚资本领投，Mayfield、NFX、Verily 和 Brook Byers 参投，使公司的融资总额超过 7000 万美元。这笔资金将推动该公司进一步开发 CRISPR 诊断和下一代 CRISPR 产品，同时该公司将其平台扩展到包括基因编辑和下一代治疗方法。Mammoth 还在探索与生物技术和制药公司的深度合作，以利用 Mammoth CRISPR 平台改变医疗保健并造福患者。CRISPR 在治疗疾病方面具有巨大的前景，Cas9 的临床试验已经在进行中——这是将 CRISPR 从实验室带入日常生活的关键一步。但是，尽管这种酶在体外环境中显示出成功的初步迹象，但在体内应用方面仍然存在挑战，限制了 Cas9 在广泛疾病领域的广泛应用。此外，Cas9 不能用于基于 CRISPR 的诊断，这是 Cas 系统的一个新兴和突破性应用。Mammoth 凭借其广泛的新型 Cas 系统组合，在克服这些障碍方面具有独特的优势，这些系统可作为诊断、基因编辑和治疗应用的工具箱。4500 万美元的 B 轮融资将推动 CRISPR 平台的开发，特别关注 Mammoth 发现的 Cas14。Cas14 是一种独特的酶，由于其极小的尺寸、多样化的靶向能力和高保真度，开辟了新的可能性。这些特性将使 Mammoth 能够实现下一代编辑，在体外和体内应用中具有更广泛的靶标范围，并为实现先进的 CRISPR 模式（如靶向基因调控、精确编辑等）奠定基础。最近，包括 Casebia（拜耳与 CRISPR Therapeutics 的合资企业）前联合创始人 Peter Nell 和 Synthego 和 Bio-Rad 前高管 Ted Tisch 在内的业内资深人士分别以首席商务官和首席运营官的身份加入了该公司，以加速公司的发展。Grail 联合创始人、前 Illumina 董事会成员 Jeff Huber 已加入公司董事会担任独立董事，斯坦福大学医学院院长 Lloyd Minor 已加入 Mammoth 顾问委员会。Mammoth Biosciences 首席执行官兼联合创始人 Trevor Martin 解释说：“作为 CRISPR 发现前沿的团队，我们亲眼目睹了对新工具的需求，以实现这项技术所提供的治疗和诊断前景。通过为诊断以外的新产品提供支持，我们正在使