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基于 RNP 的原代 CD4+T 细胞编辑...
电穿孔后 72 小时，可使用 BioLegend APC 抗人 TCR α / β 抗体通过流式细胞术评估用靶向 Edit-R sgRNA RNP 的 TRAC 或 TRBC 编辑的原代 CD4 + T 细胞的 TCR α / β 敲除情况。除了通过流式细胞术读取表型外，在基于 RNP 的编辑后 48-72 小时内，可以通过 T7EI/TIDE 测量插入/缺失形成。使用表 1 中列出的每个经过验证的 sgRNA 的引物，遵循 Dharmacon™ Edit-R™ 合成 gRNA 阳性对照试剂盒方案中的直接细胞裂解和 PCR 条件。要测量 T7EI 内切酶的插入/缺失形成，请完成上面列出的方案并使用分析软件。要通过分解 (TIDE) 分析跟踪插入/缺失来测量插入/缺失形成，请将得到的 PCR 扩增子发送至 Sanger 测序并使用网络工具，例如 http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ 。以下方案描述了用于通过流式细胞术评估原代 CD4 + T 细胞中 TCR α / β 表型敲除的染色条件。1. 通过离心（300-5 分钟）沉淀用 PPIB、NTC2、TRAC 或 TRBC 靶向 RNP 电穿孔的 CD4 + T 细胞
合成 RNA 寡核苷酸的稳定性测试
摘要 在各种储存条件下测试了三种合成 RNA 寡核苷酸的功能，以模拟运输过程中可能遇到的次优温度。通过标准 T7 内切酶 I (T7EI) 错配检测分析中的 CRISPR-Cas9 基因编辑来测量寡核苷酸的功能。虽然建议在推荐温度 (-20°C) 下储存干燥的 RNA，但所有测试条件均不会对寡核苷酸诱导基因编辑的能力产生不利影响。
基因组编辑——Alt-R™ CRISPR-Cas9 系统
图 1. Alt-RTM CRISPR-Cas9 系统核糖核蛋白的表现优于其他瞬时 CRISPR-Cas9 编辑方法。人类、小鼠或大鼠的 Alt-R CRISPR HPRT 对照 crRNA 与 Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA 复合。将所得复合物与 Cas9 表达质粒、Cas9 mRNA 或 Cas9 RNP（包含与 crRNA 和 tracrRNA 预复合的 Alt-R Sp Cas9 核酸酶 3NLS）一起转染到人类 (HEK-293)、小鼠 (Hepa1- 6) 或大鼠 (RG2) 细胞系中。使用 T7EI 测定法进行的突变检测表明，Alt-R CRISPR-Cas9 RNP 的表现优于其他瞬时 Cas9 表达方法，并且与稳定表达 S. pyogenes Cas9 的参考 HEK-293–Cas9 细胞的表现相当。
使用 Dharmacon Edit- 对斑马鱼胚胎进行显微注射……
图 1：微注射 Edit-R Cas9 核酸酶 mRNA 和合成 crRNA:tracrRNA 的斑马鱼胚胎具有可检测的编辑事件。仅微注射 Edit-R Cas9 mRNA（+/+ 泳道）或微注射 Edit-R Cas9 mRNA 加靶向 GFP 的 crRNA:tracrRNA（+ 泳道）。注射后 2 天制备基因组 DNA，并使用位于切割位点两侧的引物进行 PCR。使用 T7EI 进行 DNA 错配分析，并在 2% 琼脂糖凝胶上分离样品。使用 ImageJ 软件估计由于基因编辑而导致的插入和缺失百分比 (Indel %)，并显示在泳道底部。在所分析的斑马鱼胚胎中，75% 实现了使用靶向 GFP 的 crRNA:tracrRNA 编程的 Cas9 mRNA 的靶向 DNA 切割。
CRISPR/Cas9 介导的 EZH2 敲除抑制了……
摘要：三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性极强的乳腺癌亚型，具有肿瘤内异质性的特点，与其他类型的乳腺癌相比，TNBC更易发生侵袭和转移。本研究旨在探讨腺病毒介导的成簇调控间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统是否能够有效靶向TNBC细胞中的zeste增强子同源物2（EZH2），为CRISPR/Cas9系统用于乳腺癌的基因治疗奠定实验基础。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑工具在MDA-MB-231细胞中敲除EZH2，建立EZH2敲除（KO）组（EZH2-KO组），另设GFP敲除组（对照组）和空白组（Blank组）。通过T7 内切酶I（T7EI）酶切、mRNA检测及Western印迹实验验证载体构建及EZH2-KO成功。通过MTT、划痕实验、Transwell及体内肿瘤生物学实验检测基因编辑后MDA‑MB‑231细胞增殖及迁移能力的变化。mRNA及蛋白检测结果显示，EZH2‑KO组EZH2的mRNA及蛋白表达均明显下调。EZH2 mRNA及蛋白表达的差异在EZH2‑KO组中有所体现。