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CRISPR 技术：专利和许可格局
CRISPR-Cas 技术是基因操作领域的一项突破性工具，彻底改变了我们精确高效地编辑 DNA 的能力。该技术代表“成簇的规律间隔的短回文重复序列”（CRISPR）和 CRISPR 相关（Cas）蛋白，利用 Cas 蛋白和 RNA 分子对核酸序列进行有针对性的修改，从而产生一种多功能的基因编辑工具。CRISPR-Cas9 系统是使用最广泛的 CRISPR 系统，由加州大学伯克利分校和维也纳大学的科学家于 2012 年开发，以 Emmanuelle Charpentier 为主要负责人。同年，麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所发表了该系统在真核生物中的应用。从本质上讲，CRISPR-Cas 就像一把分子剪刀，使科学家能够精确地瞄准和修改 DNA/RNA 的特定部分。它包含两个主要组成部分：充当剪刀的 Cas 蛋白，以及引导这些蛋白质到达 DNA 链上所需位置的 RNA 分子。该过程从设计与目标 DNA 序列相匹配的引导 RNA 开始。然后，该引导 RNA 将 Cas 蛋白引导至 DNA 上的特定位置，Cas 蛋白在该位置进行精确切割。然后细胞的修复机制进行干预，要么整合所需的改变（下图中的“程序化 DNA”），要么利用细胞固有的修复机制来纠正基因异常。使用可以廉价快速合成的短引导 RNA 使其比其他基因编辑技术更容易使用，其他基因编辑技术则需要通过更费力的过程才能实现类似的结果（即：TALEN）。
使用Portmage System报告重组工程的目标效果
基因组编辑通过提供更快，更具成本效益的方法来在特定靶位点上修改细菌基因组，从而显着提高。基因组编辑很大程度上是基于诱导所需表型的遗传变异和筛查/选择（Pines等，2015）。It is now possible to target spe- cific genomic sites using indirect techniques such as programmable nucleases (CRISPR /Cas9, Zinc Finger Nucleases, and Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENS)) ( Esvelt and Wang, 2013 ) and more direct methods such as multiplex automated genome engi- neering (MAGE) ( Court et al., 2002 ; Wang et al., 2009; Wang等人，2012年；具体来说，法师使用带有所需突变的单链寡核苷酸，这些突变被重新组合到基因组中，并依赖于甲基指导的不匹配修复系统的成功失活。这最终导致背景突变率提高了两个数量级，并且脱靶突变的积累影响了未来的表型研究（CS O等人，2020年）。Nyerges等。（Nyerges等，2016）随后修改了此方法（Portmage），以克服MAGE的局限性，从而创建具有温度控制的显性负MUTL等位基因，该质粒仅在寡核苷酸整合过程中限制DNA修复以及λ红重组酶酶。这减少了细菌易受突变率增加的时间，从而降低了脱靶效应。在这里我们使用有些人甚至声称该系统的使用基本上可以消除脱靶效应（Nyerges等，2016; cs; org org o et et al。，2020）。许多人现在已经使用这些方法将新型表型与特定的核苷酸变化相关联，尽管没有报告脱靶突变的报道（Russ等，2020; Tiz等，2019; Moura de Sousa等，2017; Sato等，2018; Spohn等，2018; Spohn等，2019）。
一种用于治疗微藻污染物的合成生物学方法
全球人口和工业发展的增加导致有机和无机污染物的显着释放到水流中，威胁到人类健康和生态系统。微藻，包括真核生物和原核生物蓝细菌，已成为一种可持续且具有成本效益的解决方案，用于去除这些污染物并减轻碳排放。各种微藻物种，例如C. vulgaris，P。tricornutum，N。Oceanica，A。Platensis和C. reinhardtii，都证明了它们消除了重金属，盐度，塑料和农药的能力。合成生物学具有通过扩大治疗范围并提高污染物去除率来增强基于微藻的技术的潜力。本综述概述了微藻合成生物学的最新进展，重点是基因工程工具，以促进去除无机（重金属和盐度）以及有机（农药和塑料）化合物。这些工具的开发对于通过基因表达操纵，DNA引入细胞以及具有改变表型改变的突变体的产生来增强污染物的去除机制至关重要。此外，审查还讨论了合成生物学工具的原理，强调了基因工程在靶向特定代谢途径和创造表型变化时的重要性。它还探讨了CRISPR/CAS9和TALES等精确工程工具的使用，以使基因工程适应各种微藻物种。审查得出的结论是，基于合成生物学的方法有很大的潜力使用微藻去除污染物，但是需要扩展所涉及的工具，包括开发普遍的克隆工具包，以促进突变体的有效和快速组装突变体和转基因表达菌株，并需要适应遗传工具的遗传范围。
基于基因编辑技术的非人灵长类动物模型构建
[3] Cho J, Parks ME, Dervan PB. Cyclic polyamides for identification in the minor groove. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92: 10389-92 [4] Shen B, Zhang J, Wu H, et al. Generation of gene- modified mice via Cas9/RNA-mediated gene hunting. Cell Res, 2013, 23: 720-3 [5] Mali P, Esvelt KM, Church GM. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods, 2013, 10: 957-63 [6] Wang H, Yang H, Shivalila CS, et al. One-stepgeneration of mice carrymutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated gene engineering. Cell, 2013, 153: 910-8 [7] Wood AJ, Lo TW, Zeitler B, et al.使用ZFN和TALEN进行跨物种靶向基因组编辑。科学，2011，333：307 [8] Moscou MJ、Bogdanove AJ。TAL效应子通过一种简单的密码控制DNA识别。科学，2009，326：1501 [9] Lo TW、Pickle CS、Lin S等人。使用TALEN和CRISPR/Cas9对进化多样化的线虫进行精确且可遗传的基因组编辑以设计插入和缺失。遗传学，2013，195：331-48 [10] Cho SW、Kim S、Kim JM等人。利用Cas9 RNA引导的核酸内切酶在人类细胞中进行靶向基因组工程。自然生物技术，2013，31：230-2 [11] Gaj T、Gersbach CA、Barbas CF第3。基于ZFN、TALEN和CRISPR/Cas的基因组工程方法。Trends Biotechnol，2013，31：397-405 [12] Brandsma I, Gent DC. DNA双链断裂修复中的途径选择：平衡行为的观察。
利用 CRISPR/Cas9 技术生成和鉴定转基因人类多能干细胞的流程
由于其无限的增殖潜力、整倍体状态以及向任何细胞类型分化的能力，人类多能干细胞 (hPSC)（无论是胚胎细胞还是诱导细胞）在疾病建模和生产临床应用细胞方面具有巨大潜力 [ 1 – 3 ]。尽管已经建立了来自患有各种疾病的患者的许多 hPSC 系，但是针对某些病理或罕见基因突变生成 hPSC 系仍然具有挑战性。此外，个体间的遗传异质性可能导致生物学变异，从而使系间比较困难，尤其是来自健康对照和患者的 hPSC 之间的比较 [ 4 , 5 ]。对 hPSC 进行遗传操作的能力为我们引入、修改或校正突变以及生成遗传匹配的同基因对照系提供了机会，从而建立明确的基因型-表型关联 [ 6 , 7 ]。近年来，基于位点特异性核酸酶（包括锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)，尤其是成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 系统）的技术已使 hPSC 的基因组工程变得十分灵活 [8,9]。然而，由于 hPSC 的固有特性，包括相对较差的转染效率和转染后存活率低、难以分离克隆群、优先选择和扩增非整倍体克隆以及自发细胞分化，hPSC 工程仍然具有挑战性。为了缓解这些问题，已经描述了几种用于产生各种不同诱变事件的方案 [10-14]。尽管人们投入了大量精力来改进产生转基因 hPSC 的方法程序，但只有少数研究
儿童软组织肉瘤的 CRISP(Y) 未来
从 Jinek 等人（2012、2013）和 Qi 等人（2013）的工作开始，原核生物用于防御外源病毒的自适应系统——成簇的规律间隔回文重复序列 (CRISPR) 与 CRISPR 相关核酸内切酶 9 (Cas9) 配对，越来越多地被认可为一种强大而有效的基因组编辑工具。RNA 引导的 CRISPR/Cas9 由一条小的引导 RNA (sgRNA) 与 Cas9 复合而成，它与目标 DNA 配对会诱导单个 Cas9 依赖的双链断裂 (DSB)（由 Lino 等人，2018 年综述）。由此产生的编辑包括在活细胞基因组的特定目标区域删除或插入特定序列，或改变预先存在的 DNA 序列（图 1）。近期，该技术已得到丰富，可用于标记 DNA 区域（Banito 等人，2018 年）、调节内源基因表达（La Russa 和 Qi，2015 年）或改变表观遗传状态（Vojta 等人，2016 年）。与转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和锌指核酸酶 (ZFN) 技术相比，CRISPR/Cas9 允许进行多重分析，构建速度快且更易于递送，编辑效率更高，即使脱靶切割更频繁（Gupta 和 Musunuru，2014 年）。在过去十年中，这种方法已经进入了癌细胞存活、转移和耐药性的基础和临床前肿瘤学研究领域。在这篇小型评论中，我们将概述 CRISPR/Cas9 技术，特别关注其在揭示致瘤机制和确定一组易位阳性儿童软组织肉瘤 (STS) 中可能针对的途径中的应用。
IE 型 CRISPR-Cas 系统作为酿酒酵母的防御系统
病毒和其他移动遗传元件 (MGE) 对大多数已研究的细胞生物体而言都是潜在威胁，它们充当捕食者或降低适应性。作为应对，生物体进化出了多种防御策略，主要分为先天系统和适应性系统。先天系统的特点是被某些预设的感染特征激活。另一方面，适应性系统可以学会检测以前未被识别的病原体。长期以来，脊椎动物的适应性免疫系统是唯一已知的适应性系统的例子，但已证明古菌和细菌的成簇规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas 系统是真正的适应性免疫系统 (1)。所有已研究的 CRISPR-Cas 系统都基于短 DNA 或 RNA 序列（原间隔区），例如来自病毒基因组的序列，这些序列作为 DNA 间隔区存储在 CRISPR 基因座中。长前体 CRISPR 转录本 (pre-crRNA) 被加工成 CRISPR RNA (crRNA)，并被 Cas 蛋白效应子用来定位和摧毁匹配的靶标。根据 CRISPR-Cas 系统的类型，靶标可以是 DNA 或 RNA。CRISPR-Cas 系统种类繁多，目前分为两类。第 1 类包括 I、III 和 IV 型系统，第 2 类包括 II、V 和 VI 型系统。每种系统类型又包括几种亚型 (2, 3)。可编程核酸酶，如锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和 Cas9，可通过诱导致残突变在真核细胞中充当抗 MGE 系统。特别是，Cas9 彻底改变了真核生物的基因编辑，已被证明可以有效靶向多种人类病毒 (4)。在基本的 Cas9 技术中，DNA 切割由单一引导
基因组编辑
1）山本2018 2）Jinek M，Chylinski K，Fonfara I等。适应性细菌免疫中可编程的双RNA引导的DNA内切酶。Science，337（6096）：816-821，2012 3）Nishimasu H，Shi X，Ishiguro S等。工程CRISPR-CAS9核酸酶，具有扩展的靶向空间。Science，361（6408）：1259-1262，2018 4）RAN FA，HSU PD，LIN CY等。通过RNA引导的CRISPR CAS9进行双重划痕，以增强基因组编辑特异性。Cell，154（6）：1380-1389，2013 5）Vakulskas CA，Dever DP，Rettig GR等。作为核糖核蛋白复合物传递的高保真CAS9突变体可以在人造血茎和祖细胞中有效地编辑。nat Med。24（8），1216-1224，2018 6）Suzuki K，Tsunekawa Y，Hernandez-Benitez R等。通过CRISPR/CAS9介导的同源性靶向整合进行体内基因组编辑。 自然，540（7631）：144-149，2016 7）Sakuma T，Nakade S，Sakane Y等。 使用Talens和CRISPR-CAS9与音高系统进行 MMEJ辅助基因敲入。 自然方案，11（1），118–133，2016 8）Sakuma T，Nishikawa A，Kume S等，使用多合一的CRISPR/CAS9矢量系统在人类细胞中的多重基因组工程。 科学报告，4：5400，2014）Nishida K，Arazoe T，Yachie N等。 使用杂种p ro kar yotic yotic and d ver teb速率自适应IM MU N E系统进行靶向核苷酸编辑。 Science，353（6305）：AAF8729，2016 10）Anzalone AV，Randolph PB，Davis JR等。 搜索和重新定位基因组编辑通过CRISPR/CAS9介导的同源性靶向整合进行体内基因组编辑。自然，540（7631）：144-149，2016 7）Sakuma T，Nakade S，Sakane Y等。MMEJ辅助基因敲入。自然方案，11（1），118–133，2016 8）Sakuma T，Nishikawa A，Kume S等，使用多合一的CRISPR/CAS9矢量系统在人类细胞中的多重基因组工程。科学报告，4：5400，2014）Nishida K，Arazoe T，Yachie N等。使用杂种p ro kar yotic yotic and d ver teb速率自适应IM MU N E系统进行靶向核苷酸编辑。Science，353（6305）：AAF8729，2016 10）Anzalone AV，Randolph PB，Davis JR等。搜索和重新定位基因组编辑
辐照基因修饰的基因组编辑和...
成分和/或包装材料辐照的辐射是将食物和/或包装材料处理为特定剂量的辐射剂量的过程，因为预定义的时间长度会因病原体的生长，延迟成熟，增加产量和/或改善重新填充而导致慢速或停止变质。可以逐案允许供应商对提供给坎贝尔提供的成分和/或包装材料的辐照。应考虑适当的法规和技术。供应商应遵循每个国家/地区提供成分和/或包装材料的国家的业务要求和标签法规。基因修饰的成分遗传修饰是一种生物体，其遗传物质已使用基因工程技术改变了。坎贝尔食品的供应商应遵循其提供成分和/或食品的每个国家/地区的业务要求和标签法规。基因修改成分应根据接收国和/或州要求确定。基因组编辑“基因组编辑”是一个用来描述一组相对较新的技术的术语，使人们可以在植物，动物或其他生物体的DNA中进行精确改变。例如，这种技术可用于在生物体基因组的特定部位引入，去除或替代一个或多个特定的核苷酸。（来源，美国FDA）可以在坎贝尔事先书面许可的情况下允许供应商使用基因组编辑技术，以根据提供给坎贝尔的成分进行基因组编辑技术。基因组编辑正在使用，例如，簇插入的散布性的短腔重复相关核酸蛋白酶（CRISPR），锌指核酸酶（ZFN），转录激活剂样效应核酸核酸蛋白酶（Talens）和寡核苷酸指导性的诱导型突变型（CODM）。应考虑安全，适当的法规和技术的保证。供应商应遵循每个国家 /地区提供基因编辑成分的国家的业务要求和标签要求。纳米技术纳米技术是原子和分子量表上物质的操纵。可以允许供应商在坎贝尔的书面许可的情况下逐案使用纳米技术。应考虑适当的法规和技术。供应商在纳米技术的成分或与成分直接接触的材料中得出纳米技术以进行适当的安全评估时，应告知坎贝尔。
基于CRISPR的基因组编辑 - 茎 - disease-model- ...
抽象的干细胞，特别诱导的多能干细胞（IPSC），对再生医学和治疗治疗的未来有希望。最近，使用Talens和CRISPR来实现基因组工程目的和疾病模型的产生，已经实现了干细胞和祖细胞的操纵。但是，缺乏先进的技术一直在阻碍目前的研究和发现速度。改善的分娩可以帮助加速研究新疗法，并有助于理解疾病途径和机制。我们已经证明了lipofectamine®3000是改进的DNA递送试剂，可以实现胚胎干细胞（ESC）和IPSC中各种质粒DNA的最佳转染效率，这些质粒DNA和IPSC在传统上很难转发。替代DNA，mRNA的转染要求货物仅进入细胞质，而不是细胞核，因此降低了整合的风险，更重要的是大大提高了转染效率。在最近的一项研究中，我们在胚胎干细胞和IPSC中使用了一种特异性递送试剂Lipofectamine Messengermax™，并在Cas9-MRNA和GRNA复合物中显示了成功的遗传裂解。与质粒CAS9方法相比，CAS9 RNA方法的核酸酶介导的百分比率提高了。最近，我们已经表明，提高的indel速率直接改善了多路复用的靶向并减少脱靶效应。CAS9 RNP复合物可以在细胞进入时立即起作用，因为不需要转录和翻译。新开发的工作流程，由cas9-核糖核蛋白和专门开发的转染试剂Lipofectamine crisprmax™组成，可在Jurkat T细胞和IPSC中产生超过80％的Indel率。此外，该复合物可以从细胞中迅速清除，从而最大程度地减少了脱靶裂解事件的机会。将这些进步综合起来大大改善了下游工作流程，可以更轻松地进行干细胞操作，并增强敲入或敲除细胞模型和转基因小动物模型的产生。引言患者衍生的IPSC通过使能够进入活体供体无法获得的细胞群体，从而在细胞疗法和体外疾病建模中提供了令人兴奋的潜力。随着最近发现特定基因编辑的发现，这种真正的力量即将快到。除了特定于站点的编辑外，具有开发两个具有等基因背景的细胞模型的能力，使研究人员具有研究途径或综合征中单个突变的真实影响的潜力，进而开发了先进的疗法和治疗方法。