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嵌合抗原受体 (CAR) 重定向 T 细胞是治疗血液系统恶性肿瘤的有效选择。目前，CAR T 细胞的主要制造方法依赖于逆转录病毒转导。随着基因编辑的出现，使用腺相关病毒进行基因转移将 CD19-CAR 插入 T 细胞受体 (TCR) α恒定区 (TRAC) 基因座已得到证实，并且这些 CD19-CAR T 细胞比逆转录病毒转导的细胞表现出更好的功能性。然而，临床级病毒生产很复杂，而且成本高昂。在这里，我们优化了一种无病毒基因组编辑方法，使用 CRISPR-Cas 和双链模板 DNA (dsDNA) 通过核酸酶辅助同源性定向修复 (HDR) 将 CAR 有效地插入原代人类 T 细胞的 TRAC 基因座。我们评估了 DNA 传感器抑制和 HDR 增强作为两种药物干预措施，分别以提高细胞活力和相对 CAR 敲入率。虽然转染的 dsDNA 的毒性无法完全预防，但两种干预措施的结合显著提高了 CAR 敲入率和 CAR T 细胞产量。由此产生的 TRAC 替代 CD19-CAR T 细胞在体外表现出抗原特异性细胞毒性和细胞因子产生，并在异种移植小鼠模型中减缓了白血病进展。扩增子
TCR 敲除 Jurkat 细胞系
描述 TCR 敲除 Jurkat 细胞系是通过 CRISPR/Cas9 基因组编辑生成的，以去除 TCRα 和 β 链的 TRAC（T 细胞受体 Alpha 常数）和 TRBC1（T 细胞受体 β 常数 1）结构域。背景 T 细胞受体 (TCR) 位于 T 细胞表面，负责识别与 MHC（主要组织相容性复合体）分子结合的抗原。TCR 的参与会启动下游 NFAT 信号传导，从而导致 T 细胞活化。TCR 由两种不同蛋白质链的异二聚体组成，其中 alpha（α）和 beta（β）链是主要链。CRISPR/Cas9 基因组编辑用于去除 α 和 β 链的 TRAC（T 细胞受体 Alpha 常数）和 TRBC1（T 细胞受体 β 常数 1）区域，导致 TCR 表达丧失。应用 在生成或表征 CAR-T 细胞时用作对照 提供的材料
教师的课程
[J5] Lijia Zhou⋆，Frederic Koehler⋆，Danica J. Sutherland和Nathan Srebro。“乐观速度：线性回归中插值学习和正则化的统一理论。” ACM/IMS数据科学杂志（2023）。≥10个引用[J4] Frederik Harder，Milad Jalali Asadabadi，Danica J. Sutherland和Mijung Park。“预先训练的受欢迎的特征可改善私人图像的产生。”机器学习研究的交易（2023）。≥10个引用[J3] R´emi Flamary等。“锅：Python最佳运输。”机器学习研究杂志（2021）。机器学习开源软件纸。≥500个引用[J2] Michelle Ntampaka，Hy Trac，Danica J. Sutherland，Sebastian Fromenteau，Barnab´as p´oczos和Jeff Schneider。“使用机器学习对受污染的星系簇的动态质量测量。”天体物理学杂志831.2（2016），第1页。 135。≥50个引用[J1] Michelle Ntampaka，Hy Trac，Danica J. Sutherland，Nicholas Battaglia，Barnab´as p´oczos和Jeff Schneider。“用于银河系群的动态质量测量的机器学习方法。”天体物理学杂志803.2（2015），第1页。 50。≥100Cites
基于 RNP 的原代 CD4+T 细胞编辑...
电穿孔后 72 小时，可使用 BioLegend APC 抗人 TCR α / β 抗体通过流式细胞术评估用靶向 Edit-R sgRNA RNP 的 TRAC 或 TRBC 编辑的原代 CD4 + T 细胞的 TCR α / β 敲除情况。除了通过流式细胞术读取表型外，在基于 RNP 的编辑后 48-72 小时内，可以通过 T7EI/TIDE 测量插入/缺失形成。使用表 1 中列出的每个经过验证的 sgRNA 的引物，遵循 Dharmacon™ Edit-R™ 合成 gRNA 阳性对照试剂盒方案中的直接细胞裂解和 PCR 条件。要测量 T7EI 内切酶的插入/缺失形成，请完成上面列出的方案并使用分析软件。要通过分解 (TIDE) 分析跟踪插入/缺失来测量插入/缺失形成，请将得到的 PCR 扩增子发送至 Sanger 测序并使用网络工具，例如 http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ 。以下方案描述了用于通过流式细胞术评估原代 CD4 + T 细胞中 TCR α / β 表型敲除的染色条件。1. 通过离心（300-5 分钟）沉淀用 PPIB、NTC2、TRAC 或 TRBC 靶向 RNP 电穿孔的 CD4 + T 细胞
使用 ZF- 对分泌 IX 因子的 B 细胞进行工程改造...
分化人类 B 细胞植入的体内小鼠模型。通过腹膜内 (IP) 途径将记忆 T (Tm) 细胞注入 8 周龄 NSG 小鼠，3 2 周后静脉 (IV) 注射供体匹配、分化和工程化的 B 细胞（FIX-Padua 盒进入 TRAC 基因座）。注射后每周抽血以监测人类免疫球蛋白 (HuIg) 和 FIX-Padua 的产生。第 41 天，对小鼠实施安乐死，并回收脾脏和骨髓以评估人类 B 细胞植入的效率。
细胞治疗应用的基因修饰
细胞 从 3 名健康人类供体的新鲜白细胞分离物中分离出的 PBMC 电穿孔期间的细胞浓度 5 x 10 7 个细胞/mL 有效载荷 CTS TrueCut Cas9 蛋白 120 µg/mL 定制 TRAC sgRNA 30 µg/mL 线性 CAR 供体 dsDNA 240 µg/mL 电穿孔方案 氖系统电穿孔方案 #24 1,600 V；10 毫秒；3 个脉冲 CTS 氙气系统电穿孔方案 2,300 V；3 毫秒；4 个脉冲
变压器的弹性和高级组件（...
迄今为止，许多“智能网格”转换都集中在将高级数字信息和通信技术应用于电网上，以提高系统的可靠性，弹性，效率，灵活性和安全性。要意识到现代化的电网的全部潜力，还需要在电网物理硬件中进步。下一代网格组件可以改善设备性能和寿命，而不是当前的设计，简化高级技术的集成，并提供未来网格所需的新功能。TRAC计划支持旨在提高技术和方法的研发活动，以最大程度地提高现有网格组件的价值和寿命，并使下一代的网格硬件更具适应性，更灵活，更可靠，更可靠，并且比当今可用的技术更具成本效益。
靶向 T 细胞受体基因编辑为免疫治疗提供可预测的 T 细胞产品功能
（上，右）以及在将九个 A1/pp50 特异性全人源 TCR 通过逆转录病毒转导到 PBMCs 后，pMHC-多聚体 + 细胞的 MFI（下，右），其中有 (2xKO，蓝色) 或没有 (无 KO，灰色) 额外的内源性 TCR KO。 (c) 说明 (上) 在未发生内源性 TCR KO (无 KO，灰色)、仅发生 TCR 链 KO (TRAC KO，橙色) 和同时发生 TCR 和 链 KO (2xKO，蓝色) 的 T 细胞中内源性和转基因 TCR 之间可能存在的相互作用。对两个含有鼠恒定区的代表性 A1/pp50 特异性 TCR (26) 的内源性和转基因 TCR 进行共染色 (下) 后的流式细胞分析。 (d) 与 (c) 中所示一样，逆转录病毒转导九种 A1/pp50 特异性 TCR 后内源性 TCR（左）和转基因 TCR（右）的表达。 (e) 对于 19 种不同的 A1/pp50 特异性 TCR（每个编辑组用一个点表示），表达内源性 TCR（左）和转基因 TCR（右）的 CD8 + T 细胞的百分比。通过单因素方差分析（*** p<0.001）和 Tukey 多重比较检验进行统计检验，**** p<0.0001，** p<0.01 (f) 在两个不同的供体中，逆转录病毒 TCR 转导和额外的 TRAC KO 后表达内源性 TCR 的 CD8 + T 细胞的百分比（左）以及在额外的 2xKO 后表达转基因 TCR 的 CD8 + T 细胞的百分比（右）。在两张图中，每个点代表每个供体的 19 个 A1/pp50 特异性 TCR 中的一个。通过双尾 Spearman 相关性进行统计检验，**** p<0.0001，* p<0.05。数据代表两个独立实验。
基因敲除试剂盒
我们强烈建议您在使用靶向特异性多向导 sgRNA 之前，先使用特定细胞类型的阳性对照优化转染条件。为了优化人类细胞系的条件，EditCo 提供了转染优化试剂盒，其中包含靶向人类 TRAC 的阳性对照多向导 sgRNA。对于小鼠细胞系，我们建议使用靶向小鼠 Rosa26 的阳性对照单向导 sgRNA 来优化您的条件（请参阅第 2 页所需的其他材料）。我们建议为您的基因组编辑实验形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物，以最大限度地提高编辑效率并减少脱靶效应。选择 EditCo 的电穿孔、脂质转染或核转染方案与此试剂盒一起使用。所有方案均可在 editco.com/resources 上找到。