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CREditing：克氏锥虫基因调节工具
克氏锥虫的基因操作仍然是一个挑战，主要是因为缺乏可用且有效的分子工具。CRE-lox 重组系统是一种位点特异性重组酶技术，是一种广泛用于实现染色体或游离 DNA 中的条件性靶向缺失、倒位、插入、基因激活、易位和其他修饰的方法。在本研究中，CRE-lox 系统经过改进，以扩展当前用于这种难以操作的寄生虫的基因工具箱。为此，我们评估了通过电穿孔直接蛋白质递送 CRE 重组酶是否可以改善克氏锥虫中 CRE 介导的重组。CRE 重组酶与克氏锥虫组蛋白 H2B 的 C 端融合，H2B 携带核定位信号并在原核系统中表达。融合蛋白经过亲和纯化后直接引入上鞭毛体和组织培养衍生的锥虫中。这可以控制基因表达，如通过打开先前转染到寄生虫中的串联二聚体荧光蛋白报告基因所证实的，在高达 85% 的寄生虫中实现了 CRE 介导的重组。进一步测试了该系统关闭基因表达、去除整合到基因组中的可选择标记以及有条件地敲除与耐药性有关的硝基还原酶基因的能力。此外，CREditing 还可以控制组织培养锥虫中的基因表达，而锥虫比上鞭毛体更难转染。本研究中显示的克氏锥虫基因组操作的重大进展可供其他人使用，以帮助通过获得或丧失功能的方法更好地了解这种寄生虫。 2020 澳大利亚寄生虫学会。由 Elsevier Ltd. 出版。保留所有权利。
针对克氏锥虫的基因编辑策略
深入探索基因编辑的革命性世界，特别关注原生动物克氏锥虫，即查加斯病的病原体。这次关键会议旨在让来自拉丁美洲国家的学生掌握最新基因编辑技术的尖端知识和技能，包括突破性的 CRISPR-Cas9 系统。将有机会进行海报展示并与外国专家交流。主题包括：
基于 CRISPR/Cas9 核糖开关的克氏锥虫基因表达下调方法
在最近引入 CRISPR/Cas9 技术进行基因敲除、基因敲入、基因补充和内源基因标记之前，很少有基因工具可用于研究克氏锥虫。核糖开关是天然存在的自裂解 RNA（核酶），可被配体激活。我们实验室最近的研究结果证明了枯草芽孢杆菌中的 glmS 核酶可用于布氏锥虫的基因沉默，该核酶已被证明可控制响应外源葡萄糖胺的报告基因表达。在这项工作中，我们使用 CRISPR/Cas9 系统用活性（glmS）或非活性（M9）核酶对克氏锥虫糖蛋白 72（TcGP72）和液泡质子焦磷酸酶（TcVP1）进行内源性标记。通过 PCR 确认基因标记，并通过蛋白质印迹分析验证蛋白质下调。通过免疫荧光分析和体外生长定量进行进一步的表型表征。我们的结果表明，该方法成功地抑制了两种基因的表达，而无需培养基中的葡萄糖胺，这表明克氏锥虫在正常生长条件下产生足够水平的内源性葡萄糖胺 6-磷酸来刺激 glmS 核酶活性。该方法可用于敲除克氏锥虫中的必需基因并验证这种寄生虫中的潜在药物靶点。
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Andrade，S。G。Caracterizaçãodecepas de trypanosoma cruzi cruzi Iseladas norecôncavoBaiano。 Revista de Patologia热带。 卷。 3，p。 65-121。 1974。 Andrade，S.G。; Magalhães，J.B。锥虫菌株的生物植物和扎伊米亚：与临床数据和实验病理学的相关性。 Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical。 卷。 30，p。 27-35。 1997。 Andrade，V。; Brodskyn，c。 Andrade，S.G。 同工酶模式与克鲁氏锥虫菌株的生物bahaviour之间的相关性。 皇家热带医学和卫生学会的交易。 卷。 76，p。 796-799。 1983。 Avila，I。I.等。 通过分析PCR的分析 - 放大微圆的可变区域序列，对来自南部和中部América的Cruzi菌群的精神分裂质分析。 分子和生化寄生虫学。 卷。 42，p.175 - 188。 1990。 Britto，C。等。 一种简单的方案，用于血液样本中存在于血样中的锥虫动力学DNA的物理裂解，以及在聚合酶链反应（PCR）中使用的ITSM-基于慢性Chagas疾病的诊断。 memóriasdo Instituto Oswaldo Cruz。 。 v。88，p。 171-172.1993。 Britto，C等。 聚合酶链链反应检测人类血液样本中锥虫的锥虫瘤作为诊断和治疗评估的工具。 寄生虫学。 卷。 110，p。 241-247.1995。 ______。 等。 卷。 卷。Andrade，S。G。Caracterizaçãodecepas de trypanosoma cruzi cruzi Iseladas norecôncavoBaiano。Revista de Patologia热带。卷。3，p。 65-121。1974。Andrade，S.G。; Magalhães，J.B。锥虫菌株的生物植物和扎伊米亚：与临床数据和实验病理学的相关性。 Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical。 卷。 30，p。 27-35。 1997。 Andrade，V。; Brodskyn，c。 Andrade，S.G。 同工酶模式与克鲁氏锥虫菌株的生物bahaviour之间的相关性。 皇家热带医学和卫生学会的交易。 卷。 76，p。 796-799。 1983。 Avila，I。I.等。 通过分析PCR的分析 - 放大微圆的可变区域序列，对来自南部和中部América的Cruzi菌群的精神分裂质分析。 分子和生化寄生虫学。 卷。 42，p.175 - 188。 1990。 Britto，C。等。 一种简单的方案，用于血液样本中存在于血样中的锥虫动力学DNA的物理裂解，以及在聚合酶链反应（PCR）中使用的ITSM-基于慢性Chagas疾病的诊断。 memóriasdo Instituto Oswaldo Cruz。 。 v。88，p。 171-172.1993。 Britto，C等。 聚合酶链链反应检测人类血液样本中锥虫的锥虫瘤作为诊断和治疗评估的工具。 寄生虫学。 卷。 110，p。 241-247.1995。 ______。 等。 卷。 卷。Andrade，S.G。; Magalhães，J.B。锥虫菌株的生物植物和扎伊米亚：与临床数据和实验病理学的相关性。Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical。卷。30，p。 27-35。1997。Andrade，V。; Brodskyn，c。 Andrade，S.G。 同工酶模式与克鲁氏锥虫菌株的生物bahaviour之间的相关性。 皇家热带医学和卫生学会的交易。 卷。 76，p。 796-799。 1983。 Avila，I。I.等。 通过分析PCR的分析 - 放大微圆的可变区域序列，对来自南部和中部América的Cruzi菌群的精神分裂质分析。 分子和生化寄生虫学。 卷。 42，p.175 - 188。 1990。 Britto，C。等。 一种简单的方案，用于血液样本中存在于血样中的锥虫动力学DNA的物理裂解，以及在聚合酶链反应（PCR）中使用的ITSM-基于慢性Chagas疾病的诊断。 memóriasdo Instituto Oswaldo Cruz。 。 v。88，p。 171-172.1993。 Britto，C等。 聚合酶链链反应检测人类血液样本中锥虫的锥虫瘤作为诊断和治疗评估的工具。 寄生虫学。 卷。 110，p。 241-247.1995。 ______。 等。 卷。 卷。Andrade，V。; Brodskyn，c。 Andrade，S.G。同工酶模式与克鲁氏锥虫菌株的生物bahaviour之间的相关性。皇家热带医学和卫生学会的交易。卷。76，p。 796-799。1983。Avila，I。I.等。通过分析PCR的分析 - 放大微圆的可变区域序列，对来自南部和中部América的Cruzi菌群的精神分裂质分析。分子和生化寄生虫学。卷。42，p.175 - 188。1990。Britto，C。等。一种简单的方案，用于血液样本中存在于血样中的锥虫动力学DNA的物理裂解，以及在聚合酶链反应（PCR）中使用的ITSM-基于慢性Chagas疾病的诊断。memóriasdo Instituto Oswaldo Cruz。。v。88，p。 171-172.1993。 Britto，C等。 聚合酶链链反应检测人类血液样本中锥虫的锥虫瘤作为诊断和治疗评估的工具。 寄生虫学。 卷。 110，p。 241-247.1995。 ______。 等。 卷。 卷。v。88，p。 171-172.1993。Britto，C等。聚合酶链链反应检测人类血液样本中锥虫的锥虫瘤作为诊断和治疗评估的工具。寄生虫学。卷。110，p。 241-247.1995。 ______。 等。 卷。 卷。110，p。 241-247.1995。______。等。卷。卷。聚合酶链反应检测：对慢性chagas病的诊断的新见解。memóriasdo Instituto Oswaldo Cruz。94，p。 305-306.1999。______。等。o。被Xenodiongensis和聚合酶链反应MemóriosDo Instituto Oswaldo Cruz揭示的经过治疗的chagasic患者的寄生虫持久性。v。96，2001。p。 1-4。 Clark，C。G.核糖增生：原生动物分类法的分子方法。 in：Lee，J.J。 ＆Soldo，A.T。 （ed。 ）：原子学方面的协议。 Allen Press。 1992。 Clark，C.G。 ; Martin，D.S。 ; Diamond，L.S。 ruboprinting揭示的Anuran锥虫之间的系统发育关系。 真核微生物学杂志。 42，p。 92-96。 1999。 Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。 in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。 ）：人类寄生虫； ed。 雅典。 2002。v。96，2001。p。 1-4。Clark，C。G.核糖增生：原生动物分类法的分子方法。in：Lee，J.J。 ＆Soldo，A.T。（ed。）：原子学方面的协议。Allen Press。 1992。 Clark，C.G。 ; Martin，D.S。 ; Diamond，L.S。 ruboprinting揭示的Anuran锥虫之间的系统发育关系。 真核微生物学杂志。 42，p。 92-96。 1999。 Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。 in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。 ）：人类寄生虫； ed。 雅典。 2002。Allen Press。1992。Clark，C.G。 ; Martin，D.S。 ; Diamond，L.S。 ruboprinting揭示的Anuran锥虫之间的系统发育关系。 真核微生物学杂志。 42，p。 92-96。 1999。 Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。 in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。 ）：人类寄生虫； ed。 雅典。 2002。Clark，C.G。; Martin，D.S。; Diamond，L.S。ruboprinting揭示的Anuran锥虫之间的系统发育关系。真核微生物学杂志。42，p。 92-96。 1999。 Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。 in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。 ）：人类寄生虫； ed。 雅典。 2002。42，p。 92-96。1999。Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。 in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。 ）：人类寄生虫； ed。 雅典。 2002。Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。）：人类寄生虫； ed。雅典。2002。
使用 AlphaFold 对寄生虫克氏锥虫进行药物靶点的计算机模拟探索
恰加斯病是一种由克氏锥虫引起的、被忽视的毁灭性疾病，影响着全球数百万人。现有的两种抗寄生虫药物硝呋莫司和苯并硝唑对感染的急性期有良好的疗效。但急性期疗效较差，通常无症状，因此经常无法诊断。治疗大多发生在慢性期，即出现危及心脏和/或消化系统的致命症状时。此后，这两种药物的疗效都会降低，而且长期服药常常会产生不良反应，影响治疗依从性。因此，迫切需要发现更安全、更有效的药物。尽管与最近使用的表型筛选相比，基于靶标的新型抗寄生虫分子的鉴定具有优势，但由于注释不完整以及缺乏寄生虫蛋白质空间结构，因此受到阻碍。目前，AlphaFold 蛋白质结构数据库拥有 19,036 个来自克氏锥虫的蛋白质模型，这些模型不仅可以成为描述新治疗方法的关键，还可以阐明已知化合物的分子作用机制。在这项概念验证研究中，我们筛选了 AlphaFold 克氏锥虫预测蛋白质模型集，以使用基于对接的逆向虚拟筛选为预先选择的已知抗锥虫活性的化合物列表寻找潜在靶标。详细分析了最有希望的配体的最佳受体（靶标），以解决分子相互作用和潜在药物的作用方式。结果深入了解了化合物及其靶标的作用机制，并为寻找新化合物或优化现有化合物的新策略铺平了道路。
一种新型的nabelschnur蛋白调节锥虫瘤中动力学DNA的分离
线粒体的获取对于启动真核生成至关重要，因此是真核细胞的特征。1,2寄生虫锥虫Brucei包含一个具有独特的线粒体基因组的奇异线粒体，称为动力体DNA（kDNA）。3在核DNA复制开始之前，在细胞周期的G 1期间复制了kDNA cur。4尽管已经在功能上表征了许多蛋白质，并将其鉴定为kDNA补充和分裂的重要组成部分，但管理这种高度精确过程的分子机制仍然很少知道。5,6一种与形态相关的和形态学特征的结构仍然是最神秘的，是“ nabelschnur”，是一种未构成的，纤维状的，使其成熟的结构观察到的，这是通过电子显微镜看到的隔离子女kDna网络。7–9迄今为止，只有一种蛋白质TBLAP1，一种M17家族亮氨肽酶金属蛋白酶，已知可以定位于Nabelschnur。9筛选Brucei Mitotag项目中的蛋白质时，10我们鉴定了一种先前未表征的蛋白质，并具有位于kDNA的mneongreen信号，并形成了分裂KDNA之间的连接点。在这里，我们证明了该KDNA相关的蛋白质，称为TBNAB70，确实位于Nabelschnur，并在新复制的KDNA的分离中起着至关重要的作用，并在Brucei T. Brucei中的随后的细胞因子。
化脓性链球菌 Cas9 核糖核蛋白递送，用于在锥虫和利什曼原虫中进行高效、快速和无标记的基因编辑
图 1 布氏锥虫 PCF 中的 GFP 失活。（a）对组成性表达胞浆 eGFP 的布氏锥虫进行荧光流式细胞术分析。在用 20 μ g（无 Cas9、Cas9/gRNA GFP1、Cas9/gRNA GFP2、Cas9/gRNA GFP3）或 60 μ g（Cas9/gRNA GFP2）来自 IDT 的 RNP 复合物转染后 24 至 72 小时随时间监测 GFP 荧光，条形图显示用不同向导转染后 72 小时 GFP 阴性细胞的百分比（n = 3）。采用 Prism 软件进行统计分析，采用 t 检验（非配对、正态分布、参数检验和双尾）。显着性水平（p 值）用星号表示。 （b）上图显示了允许 e Sp Cas9 在大肠杆菌中表达的质粒的示意图。蓝色框表示蛋白质 N 端和 C 端的两个多组氨酸序列，红色框表示 TEV 和肠激酶 (EK) 蛋白酶的切割位点，灰色框表示三个核定位信号 (NLS)，黑色框表示 FLAG 表位的三个重复，橙色框表示 e Sp Cas9 编码序列。下图显示了在用来自 IDT 或实验室纯化 (Lab) 的 RNPs 复合物 (无 Cas9、20 μ g Cas9/gRNA GFP2、40 μ g Cas9/gRNA GFP2、40、60 和 80 μ g Cas9/gRNA GFP2) 转染后 72 小时监测的表达 GFP 的 T. brucei 的荧光流式细胞术分析。（c）不再表达 GFP 的克隆中 GFP 基因的一部分的序列比较。该序列仅显示 GFP2 向导 RNA 所针对的区域。灰色框（H1 和 H2）突出显示可能用于 MMEJ 修复的同源区域。由实验室纯化的 Cas9 失活产生的序列和来自商业 Cas9 的序列分别标记为 Lab 和 IDT。下面显示了 Dc6 和 Ba10 克隆的相应色谱图（置信区间 95%— p 值样式：0.1234 (ns)；0.0332 (*)；0.0021 (**)；0.0002 (***)；< 0.0001 (****)）。
牛皮物种的反寄生虫活性以及山苯胺和苯尼唑之间针对锥虫的锥虫
1生物学家研究所，圣约翰国立大学工程师学院。2，，组织学家和外皮学家研究所“博士Mario H. Burgos”，Concower国立大学，Mendoza CP 5500，农场学院的食品食品，巴塞罗那大学，西班牙巴塞罗那08028 *通信：这些作者做出了贡献。
转运蛋白而非药物靶标的差异是刚果锥虫和锥虫亚属锥虫对二脒和三聚氰胺苯砷剂具有不同先天敏感性的主要决定因素
摘要：动物锥虫病是感染各种非洲锥虫种类的动物的疾病，例如布氏锥虫、伊氏锥虫、刚果锥虫、马背锥虫和间日锥虫。症状因宿主和感染物种以及感染阶段而异，可使用数十年前的少量锥虫杀虫剂进行治疗。一个复杂的问题是，并非所有锥虫物种对所有药物都同样敏感，而原因至多只是部分了解。在这里，我们研究药物转运蛋白（主要在布氏锥虫中发现）是否决定了不同的药物敏感性。我们报告称，氨基嘌呤转运蛋白 TbAT1 和水通道蛋白 TbAQP2 的同源物在刚果锥虫中不存在，而它们的引入使该物种对二脒（喷他脒、二脒氮）和三聚氰胺苯（美拉索明）类药物非常敏感。这些药物在转基因株系中的积累速度要快得多。刚果锥虫对苏拉明的敏感性本质上也低于布氏锥虫，尽管它对苏拉明的积累速度更快。在刚果锥虫中表达位于布氏锥虫溶酶体中的一种拟议的苏拉明转运蛋白并没有改变其对苏拉明的敏感性。我们得出结论，对于几类最重要的锥虫药而言，特定转运蛋白的存在，而不是药物靶标，才是药物疗效的决定性因素。