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茄科作物病毒诱导基因组编辑方法的开发
使用 CRISPR/Cas 系统的基因组编辑 (GE) 彻底改变了植物诱变。然而，传统的转基因介导的 GE 方法存在局限性，因为通过组织培养生成表达 Cas9/单向导 RNA (sgRNA) 模块的稳定转基因系需要花费很长时间。病毒诱导的基因组编辑 (VIGE) 系统已成功用于模型植物，例如拟南芥和烟草属。在本研究中，我们开发了两种用于茄科植物的 VIGE 方法。首先，我们使用烟草脆裂病毒 (TRV) 载体将 sgRNA 递送到表达 Cas9 的转基因番茄 (Solanum lycopersicum) 品种 Micro-Tom 品系中。其次，我们设计了一种基于马铃薯病毒 X (PVX) 载体的非转基因 GE 方法来递送 Cas9 和 sgRNA。我们设计并克隆了靶向八氢番茄红素去饱和酶的 sgRNA，并将其放入 VIGE 载体中，并确定了 VIGE 的最佳条件。我们通过病毒载体接种后对靶基因的深度测序来评估 VIGE 效率，检测到 TRV 和 PVX 介导的 GE 的突变率分别为 40.3% 和 36.5%。为了提高编辑效率，我们采用了 37 ◦ C 热处理，这分别使 TRV 和 PVX 介导的 VIGE 的编辑效率提高了 33% 至 46% 和 56% 至 76%。为了获得编辑植物，我们对接种的子叶进行了组织培养，获得了成功的编辑事件。我们还证明 PVX 介导的 GE 可应用于其他茄科作物，例如马铃薯 (Solanum tuberosum) 和茄子 (Solanum melongena)。这些简单且高效的 VIGE 方法在茄科作物中生成基因组编辑植物方面具有巨大潜力。
病毒诱导的基因编辑及其在植物中的应用
摘要：基于 CRISPR/Cas 的基因组编辑技术可以精确操作植物基因组，彻底改变了植物科学，并使得创造具有有益特性的种质成为可能。为了应用这些技术，必须将 CRISPR/Cas 试剂递送到植物细胞中；然而，这受到组织培养挑战的限制。最近，病毒载体已用于将 CRISPR/Cas 试剂递送到植物细胞中。病毒诱导基因组编辑 (VIGE) 已成为一种强大的方法，具有多种优势，包括高编辑效率和生成无 DNA 基因编辑植物的简化过程。在这里，我们简要介绍了基于 CRISPR/Cas 的基因组编辑。然后，我们重点介绍 VIGE 系统和目前用于 CRISPR/Cas9 盒递送和基因组编辑的病毒类型。我们还重点介绍了 VIGE 在植物中的最新应用和进展。最后，我们讨论了 VIGE 在植物中的挑战和潜力。
病毒诱导基因沉默在蔬菜功能研究中的应用及拓展
摘要：增加蔬菜摄入量已成为世界范围内健康饮食习惯的一部分，因此，明确育种材料中的基因功能对于蔬菜改良以满足蔬菜新品种的可持续发展至关重要。然而，遗传转化费时费力，限制了对各类蔬菜作物基因功能的探索。病毒诱导的基因沉默（VIGS）由于缩短了实验周期并且不依赖于稳定的遗传转化，可以在植物中进行大规模、快速的基因沉默，为功能研究提供了绝佳的机会。VIGS可以加速模式植物研究，使蔬菜作物基因功能的分析和验证变得更加容易。此外，随着病毒介导的异源蛋白表达等技术的出现和CRISPR/Cas9技术的发展，病毒介导的遗传工具开创了遗传学和作物改良的新时代。本研究总结了蔬菜中VIGS和病毒诱导的基因编辑（VIGE）的最新成果。我们还确定了蔬菜中 VIGS 技术当前面临的几个挑战，为未来的研究提供指导。
通过单农杆菌系统简化植物基因沉默和基因组编辑物流，同时递送多部分病毒载体
图 1 JoinTRV 的设计，这是一种基于具有兼容来源的微型 T-DNA 载体的 TRV 表达系统。(A) 烟草脆裂病毒 (TRV) 的基因组组织。(B) TRV RNA2 工程用于序列克隆和表达。pLX-TRV2 的克隆盒图与 Bsa I 识别位点和 Bsa I 产生的突出端一起显示（底部）。LacZ 报告基因允许可视化选择重组载体；插入物的植物表达由豌豆早褐病毒 (PEBV) 外壳蛋白 (CP) 启动子驱动。(C) VIGS (pTRV2) 和 VIGE (pRNA2.PEBV) 中描述的 pLX-TRV2 和 TRV RNA2 载体的尺寸比较。(D) JoinTRV 系统图。两个 T-DNA 载体被多路复用到单个农杆菌细胞中，以同时递送 TRV 基因组成分。 pLX-TRV2 是 pLX-B2 衍生物，具有 pBBR1 来源和卡那霉素抗性基因 (npt I)，pLX-TRV1 是 pLX-Z4 衍生物，具有 RK2 来源和庆大霉素抗性基因 (aac C1)；由于这两个 T-DNA 载体具有兼容的来源和独立的抗生素选择机制，因此可以同时寄宿在同一细菌细胞中