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标准化的术语和PACBIO HIFI测序和RAAV基因治疗载体分析的报告
尽管重组腺相关病毒（RAAV）是基因疗法的主要平台，但缺乏标准化的计算分析方法和通过长阅读测序评估每个帽子的内容的报告。PACBIO高度准确的长阅读HIFI测序可以对AAV基因组进行全面表征，但需要生物信息学专业知识来分析，解释和比较结果。为了满足这一需求并提高对功能性病毒有效载荷的理解，我们的工作组建立了标准化的命名法，并报告了RAAV矢量的长阅读测序数据。工作组建议涵盖与矢量纯度（全长与零散基因组）和污染物（宿主DNA，质粒DNA）鉴定有关的关键质量属性（CQA）。通过推荐的协议，我们对从头制造的数据分析揭示了全部和部分填充的衣壳的特异性以及部分/截断的载体物种的高分辨率表征。最后，我们提供了实施此
使用两种兼容的 RNA 病毒载体在全植物水平上进行 CRISPR-Cas12a 基因组编辑
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者，此版本于 2021 年 4 月 19 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.04.19.440450 doi：bioRxiv 预印本
基于CRISPR/CAS的基因编辑系统传递的慢病毒载体：当前状态和观点
摘要：CRISPR/CAS技术通过提供对基因组序列和表达的无与伦比的控制，彻底改变了基因组和表观基因组编辑的领域。慢病毒载体（LV）系统是CRISPR/CAS系统的主要输送车辆之一，因为（i）其携带笨重且复杂的转基因的能力以及（ii）在体外和体内的广泛分裂和非分裂细胞中维持强大而长期的长期表达。因此，合理地将大量努力分配为开发改进和优化的LV系统，以进行有效，准确的CRISPR/CAS工具转移基因转移。这一目的的主要努力是为了改善和优化矢量的表达，整合酶溶剂较高的慢病毒载体（IDLV）的发展，旨在最大程度地减少致癌性，毒性和致病性的风险以及增强临床应用的制造方案。在这篇综述中，我们将注意（i）慢病毒的基本生物学，以及（ii）开发更安全且有效的CRISPR/CAS矢量系统的最新进展，用于在临床前和临床应用中的使用。此外，我们将详细讨论与基础编辑和原始编辑应用相关的CRISPR/CAS系统的重新使用方面的最新进展。
使用纳米孔直接 RNA 测序对基因治疗载体进行质量控制的优化方案
尽管最近在提高慢病毒基因疗法的疗效方面取得了进展，但相当一部分生产的载体含有不完整且可能无功能的 RNA 基因组。这可能会破坏慢病毒的基因传递，并增加制造成本，必须加以改进以促进慢病毒基因疗法的广泛临床实施。在这里，我们比较了三种长读测序技术检测载体设计问题的能力，并确定纳米孔直接 RNA 测序是最强大的。我们展示了这种方法如何识别和量化由隐蔽剪接和多聚腺苷酸化位点引起的不完整 RNA，包括广泛使用的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件 (WPRE) 中的潜在隐蔽多聚腺苷酸化位点。使用慢病毒 RNA 的人工多聚腺苷酸化，我们还在分析的慢病毒载体中识别出多个发夹相关截断，这些截断占检测到的 RNA 片段的大部分。最后，我们表明这些见解可用于优化慢病毒载体设计。总之，纳米孔直接 RNA 测序是慢病毒载体质量控制和优化的有力工具，可能有助于改进慢病毒制造，从而开发更高质量的慢病毒基因疗法。
优化的策略，用于实时qPCR检测池smulium sp。 blackfly矢量
1美国北安普敦史密斯学院生物科学系，美国美国，美国2号生物科学系，昆尼皮亚西亚三世大学，昆尼皮亚克大学，汉姆登，康涅狄格州，美国康涅狄格州，美国寄生疾病3实验室，美国国家医学院，美国伯兰群岛，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国。 Missouri, United States of America, 5 Laboratory of Molecular Parasitology, Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center, New York, New York, United States of America, 6 Institute of Medical Microbiology, Immunology and Parasitology, University Hospital Bonn, Bonn, Germany, 7 German Center for Infection Research (DZIF), Partner-Site Bonn-Cologne, Bonn, Germany, 8 Center for Global Health Infectious Disease Research, University of South Florida, Tampa, Florida, United States of America, 9 Parasite and Vectors Research Unit, Department of Microbiology and Parasitology, University of Buea, Buea, Cameroon, 10 Research Foundation in Tropical Diseases and the Environment, Buea, Cameroon, 11 NTD-SC, Task Force for Global Health, Atlanta, Georgia, United States of America, 12 RLMF, The END Fund, New York, New美国，美国，美国马萨诸塞州阿默斯特大学，美国马萨诸塞州阿默斯特大学的13分子和蜂窝生物学计划
通过单农杆菌系统简化植物基因沉默和基因组编辑物流，同时递送多部分病毒载体
图 1 JoinTRV 的设计，这是一种基于具有兼容来源的微型 T-DNA 载体的 TRV 表达系统。(A) 烟草脆裂病毒 (TRV) 的基因组组织。(B) TRV RNA2 工程用于序列克隆和表达。pLX-TRV2 的克隆盒图与 Bsa I 识别位点和 Bsa I 产生的突出端一起显示（底部）。LacZ 报告基因允许可视化选择重组载体；插入物的植物表达由豌豆早褐病毒 (PEBV) 外壳蛋白 (CP) 启动子驱动。(C) VIGS (pTRV2) 和 VIGE (pRNA2.PEBV) 中描述的 pLX-TRV2 和 TRV RNA2 载体的尺寸比较。(D) JoinTRV 系统图。两个 T-DNA 载体被多路复用到单个农杆菌细胞中，以同时递送 TRV 基因组成分。 pLX-TRV2 是 pLX-B2 衍生物，具有 pBBR1 来源和卡那霉素抗性基因 (npt I)，pLX-TRV1 是 pLX-Z4 衍生物，具有 RK2 来源和庆大霉素抗性基因 (aac C1)；由于这两个 T-DNA 载体具有兼容的来源和独立的抗生素选择机制，因此可以同时寄宿在同一细菌细胞中
AAV 载体中新型组合 microRNA 结合位点协同减少抗原呈递和转基因免疫，实现高效、稳定的转导
重组腺相关病毒 (rAAV) 平台有望用于体内基因治疗，但抗原呈递细胞 (APC) 的不良转导会削弱其应用前景，而抗原呈递细胞又会引发宿主对 rAAV 表达的转基因产物的免疫。鉴于最近接受高剂量全身 AAV 载体治疗的患者出现的不良事件，推测这些不良事件与宿主的免疫反应有关，开发抑制先天性和适应性免疫的策略势在必行。使用 miRNA 结合位点 (miR-BS) 来赋予内源性 miRNA 介导的调控，使转基因表达脱离 APC，有望降低转基因免疫力。研究表明，将 miR-142BSs 设计到 rAAV1 载体中能够抑制树突状细胞 (DC) 中的共刺激信号、减弱细胞毒性 T 细胞反应并减弱小鼠转导肌细胞的清除，从而允许在肌纤维中持续转基因表达，同时几乎不产生抗转基因 IgG。在本研究中，我们针对 26 种在 APC 中大量表达但在骨骼肌中不表达的 miRNA 筛选了单个和组合 miR-BS 设计。高免疫原性卵清蛋白 (OVA) 转基因被用作外来抗原的替代物。在成肌细胞、小鼠 DC 和巨噬细胞中进行的体外筛选表明，miR-142BS 和 miR-652-5pBS 的组合强烈抑制了 APC 中的转基因表达，但保持了成肌细胞和肌细胞的高表达。重要的是，携带这种新型 miR-142/652-5pBS 盒的 rAAV1 载体在小鼠肌肉注射后比以前的去靶向设计实现了更高的转基因水平。该盒强烈抑制细胞毒性 CTL 激活和
新的整合载体可增加农杆菌的转化并有助于表征大豆 GmTML 基因家族成员的作用
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2024 年 7 月 26 日发布。；https://doi.org/10.1101/2024.07.25.605222 doi：bioRxiv 预印本
CRISPR/Cas 与核糖核蛋白复合物和瞬时选择端粒载体可在灰葡萄孢菌中实现高效的无标记和多重基因组编辑
CRISPR/Cas 已成为多种生物体中遗传操作的最先进的技术，能够以前所未有的效率进行有针对性的遗传改变。本文中，我们报告了在重要的坏死性植物病原体灰霉病中首次建立强大的 CRISPR/Cas 编辑，该方法基于将优化的 Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物 (RNP) 引入原生质体。通过开发一种将 RNP 递送与含端粒的瞬时稳定载体共转化相结合的新策略，进一步提高了编辑产量，从而允许临时选择和方便地筛选无标记编辑事件。我们证明，与现有的基于 CRISPR/Cas 的丝状真菌方法（包括模型植物病原体稻瘟病菌）相比，这种方法提供了更高的编辑率。编辑菌株的基因组测序显示很少有额外的突变，也没有 RNP 介导的脱靶证据。端粒载体介导编辑的高性能通过随机诱变 sdhB 基因的 272 个密码子得到证实，该基因是琥珀酸脱氢酶抑制剂 (SDHI) 杀菌剂抗性的主要决定因素，方法是将 272 个密码子批量替换为编码所有 20 种氨基酸的密码子。在没有选择的情况下，所有交换的频率都相似，但 SDHI 选择允许识别新的氨基酸替换，这些替换赋予了对不同 SDHI 杀菌剂的不同抗性水平。基于 RNP 的共转化效率提高且易于操作，有望加速 B . cinerea 和其他真菌的分子研究。