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通过 DNA 甲基化编辑人工逃离 XCI......
大量 X 连锁基因逃避 X 染色体失活，并与独特的表观遗传特征相关。与 X 逃避密切相关的一种表观遗传修饰是启动子区域的 DNA 甲基化降低。在这里，我们通过编辑 CDKL5 启动子上的 DNA 甲基化，从人类类神经元细胞中沉默的 X 染色体等位基因中创建了一种人工逃避，CDKL5 是一种导致婴儿癫痫的基因。我们发现，使用三个向导 RNA 将 TET1 的催化域与靶向 CDKL5 启动子的 dCas9 融合，结合从 CpG 二核苷酸中去除甲基，可显著重新激活失活等位基因。令人惊讶的是，我们证明 TET1 和 VP64 转录激活因子的共表达对非活性等位基因的重新激活具有协同作用，使活性等位基因的水平超过 60%。我们进一步使用多组学评估来确定转录组和甲基化组上的潜在脱靶。我们发现 dCas9 效应物的协同传递对靶位点具有高度选择性。我们的研究结果进一步阐明了与逃避 X 染色体失活相关的 DNA 甲基化降低的因果作用。了解与逃避 X 染色体失活相关的表观遗传学对患有 X 连锁疾病的人有很大的帮助。
通过对 CDKL5 基因进行 DNA 甲基化编辑，人工逃避 XCI
大量 X 连锁基因逃避 X 染色体失活，并与独特的表观遗传特征相关。与 X 逃避密切相关的一种表观遗传修饰是启动子区域的 DNA 甲基化降低。在这里，我们通过编辑 CDKL5 启动子上的 DNA 甲基化，从人类类神经元细胞中沉默的 X 染色体等位基因中创建了一种人工逃避，CDKL5 是一种导致婴儿癫痫的基因。我们发现，使用三个向导 RNA 将 TET1 的催化域与靶向 CDKL5 启动子的 dCas9 融合，结合从 CpG 二核苷酸中去除甲基，可显著重新激活失活等位基因。令人惊讶的是，我们证明 TET1 和 VP64 转录激活因子的共表达对非活性等位基因的重新激活具有协同作用，使活性等位基因的水平超过 60%。我们进一步使用多组学评估来确定转录组和甲基化组上的潜在脱靶。我们发现 dCas9 效应物的协同传递对靶位点具有高度选择性。我们的研究结果进一步阐明了与逃避 X 染色体失活相关的 DNA 甲基化降低的因果作用。了解与逃避 X 染色体失活相关的表观遗传学对患有 X 连锁疾病的人有很大的帮助。
紫外激发微分干涉对比热透镜显微镜的开发，用于蛋白质分子计数
这种空间的体积如此之小，分析物分子的数量正在减少，需要单分子水平的检测方法。特别是，单个非荧光分子的检测非常重要，因为大多数分子没有荧光。相反，我们开发了用于灵敏检测非荧光分子的热透镜显微镜 (TLM)，并实现了在 7 fL 中测定 0.4 个分子的浓度 [1] 和使用紫外激发激光计数单个大型生物分子 (λ-DNA) [2]。然而，由于光学背景较大，这是基于 TLM 原理的一个问题，因此无法实现蛋白质等小分子的计数。因此，我们通过引入微分干涉对比 (DIC) 显微镜的原理开发了微分干涉对比热透镜显微镜 (DIC-TLM) 以实现无背景检测。到目前为止，DIC-TLM 可以实现对单个非荧光分子的检测 [3]，而之前的 DIC-TLM 使用可见光激发，无法检测在紫外线范围内有吸收的生物分子。本文开发了一种新型紫外激发DIC-TLM（UV-DIC-TLM）用于检测单个蛋白质分子。具体而言，设计了用于紫外激发的DIC棱镜和显微镜等光学元件，验证了UV-DIC-TLM的原理并评估了其性能。
紫外激发微分干涉对比热透镜显微镜的开发，用于蛋白质分子计数
这种空间的体积如此之小，分析物分子的数量正在减少，需要单分子水平的检测方法。特别是，单个非荧光分子的检测非常重要，因为大多数分子没有荧光。相反，我们开发了用于灵敏检测非荧光分子的热透镜显微镜 (TLM)，并实现了在 7 fL 中测定 0.4 个分子的浓度 [1] 和使用紫外激发激光计数单个大型生物分子 (λ-DNA) [2]。然而，由于光学背景较大，这是基于 TLM 原理的一个问题，因此无法实现蛋白质等小分子的计数。因此，我们通过引入微分干涉对比 (DIC) 显微镜的原理开发了微分干涉对比热透镜显微镜 (DIC-TLM) 以实现无背景检测。到目前为止，DIC-TLM 可以实现对单个非荧光分子的检测 [3]，而之前的 DIC-TLM 使用可见光激发，无法检测在紫外线范围内有吸收的生物分子。本文开发了一种新型紫外激发DIC-TLM（UV-DIC-TLM）用于检测单个蛋白质分子。具体而言，设计了用于紫外激发的DIC棱镜和显微镜等光学元件，验证了UV-DIC-TLM的原理并评估了其性能。