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化学修饰的 AsCas12a 向导 RNA 可改善不同组织中脂质纳米颗粒介导的体内基因编辑
（Cytiva）。LNP 货物是编码工程 AsCas12a 核酸酶和 gRNA 的 mRNA，重量比为 1:1。通过 RiboGreen 测定法（ThermoFisher Scientific）评估 LNP 的包封率大于 80%，多分散性指数 (PDI) <0.2，通过 Zetasizer 分析（Malvern Panalytical，型号 ZSU3205）评估平均直径大小 <105 nm。• 细胞培养处理：用指定浓度的包封 AsCas12a mRNA 的 LNP 处理细胞，并在转染后 72 小时分离 gDNA。原代人肝细胞 (PHH) 的转染包括重组人载脂蛋白 E。进行基于扩增子的下一代测序 (NGS) 以确定编辑百分比。 • 小鼠眼内体内编辑：通过前房内注射将 LNP 递送至每只 hMYOC Y437H（具有 Y437H 突变的人类肌动蛋白基因）敲入小鼠的一只眼中。注射后一周，解剖眼球，从前房分离 mRNA。采用基于转录本的 RT-ddPCR 检测来测量剩余 hMYOC mRNA 的程度。 • 小鼠肝脏内体内编辑：通过尾静脉静脉注射将 LNP 递送至 hMYOC Y437H 小鼠。注射后一周，解剖肝脏，分离 gDNA，并进行基于扩增子的 NGS 以确定编辑百分比。 • 体外结合亲和力测量：将标记的未修饰的向导与重组工程 AsCas12a 和浓度不断增加的修饰“测试”向导混合，在室温下孵育 3 小时，然后在硝酸纤维素印迹膜 (Cytiva) 和 Hybond N+ 膜 (Cytiva) 上进行双重过滤分离。在每个膜上定量荧光标记的未修饰向导，并计算结合的未修饰向导的百分比。标记的未修饰向导的结合百分比降低是由于来自修饰的“测试”向导的结合竞争。
AAV 介导的青光眼和葡萄膜炎基因疗法
缩写：AAV：腺相关病毒；ABCA1：ATP 结合盒转运蛋白 A1；ACE2：血管紧张素转换酶 2；ANXA1：膜联蛋白 A1；Bcl-2：B 细胞白血病/淋巴瘤 2；Bcl-xL：超大 B 细胞淋巴瘤；BDNF：脑源性神经营养因子；Brn3b：脑特异性同源框/POU 结构域蛋白 3b；C3：C3 胞外酶转移酶；CNV：脉络膜新生血管；CS：皮质类固醇；EAU：实验性自身免疫性葡萄膜炎；ECM：细胞外基质；EIU：内毒素诱导的葡萄膜炎；HLA：人类白细胞抗原；hSyn：人类突触蛋白 1 启动子；IL-1 β：白细胞介素 1 β；IOP：眼压； IRBP：光感受器间类视黄酸结合蛋白；MAC：膜攻击复合物；MAX：MYC 相关蛋白 X；MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1；MMP：基质金属蛋白酶；Nabs：中和抗体；NF- κ B：核因子 κ B；NHP：非人类灵长类动物；NIU：非传染性葡萄膜炎；Nrf2：核因子红细胞2相关因子2；Pgk：磷酸甘油激酶；RGC：视网膜神经节细胞；RPE：视网膜色素上皮；scAAV：自互补 AAV；sCD59：可溶性 CD59；SOD2：超氧化物歧化酶 2；Tg-MYOC Y437H：具有肌动蛋白 Y437H 突变的转基因小鼠；TLR：Toll 样受体；TM：小梁网； TrkB：原肌球蛋白相关受体激酶-B；VEGF：血管内皮生长因子
慢病毒介导的 CRISPR/Cas9 递送可降低小鼠青光眼模型中的眼压
肌动蛋白 ( MYOC ) 突变是已知的原发性开角型青光眼的主要遗传原因，约占所有病例的 4%。MYOC 突变会导致功能获得性表型，其中突变的肌动蛋白会在内质网 (ER) 中积聚，导致 ER 应激和小梁网 (TM) 细胞死亡。因此，在基因组水平上敲除肌动蛋白是永久治愈该疾病的理想策略。我们之前已成功利用 CRISPR/Cas9 基因组编辑通过腺病毒 5 (Ad5) 靶向 MYOC。但是，Ad5 不是适合临床使用的载体。在这里，我们试图确定腺相关病毒 (AAV) 和慢病毒 (LV) 靶向 TM 的功效。首先，我们通过玻璃体内 (IVT) 和前房 (IC) 注射检查了单链 (ss) 和自互补 (sc) AAV 血清型以及表达 GFP 的 LV 的 TM 趋向性。我们观察到 LV_ GFP 表达对通过 IVT 途径注射的 TM 更具特异性。色氨酸突变体 scAAV2 的 IC 注射显示 TM 中 GFP 的显著表达。然而，在睫状体和视网膜中也观察到了强劲的 GFP 表达。我们接下来构建了表达 Cas9 和靶向 MYOC (crMYOC) 的引导 RNA (gRNA) 的慢病毒颗粒，并用 LV_cr MYOC 转导稳定表达突变型肌动蛋白的 TM 细胞可显著减少肌动蛋白积累及其相关的慢性 ER 应激。在 Tg-MYOC Y437H 小鼠中单次 IVT 注射 LV_cr MYOC 可减少 TM 中的肌动蛋白积累并显著降低升高的眼压。总之，我们的数据表明，LV_cr MYOC 靶向 TM 中的 MYOC 基因编辑并挽救了肌动蛋白相关青光眼的小鼠模型。