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从无DNA的植物再生葡萄藤原生质体Simone scintilla 1*，Umberto salvagnin 1，Lisa Giacomelli 2，Tieme Zeilmaker 2，
从无DNA编辑的葡萄藤原生质体中的植物再生Simone scintilla 1*，Umberto salvagnin 1，Lisa Giacomelli 2，Tieme Zeilmaker 2，Mickael A. Mickael A. Malnoy A. Malnoy 1，Jeroen Rouppe Van der Voort 2，Claudio Moser 1。1果实作物，研究与创新中心的基因组学和生物学系，E. Mach 1，I-38010，San Michele A/Adige（TN）意大利； 2 Enza Zaden，Haling 1-E，1602 dB，Enkhuizen，荷兰。*通讯作者：Simone Scintilla博士（Simone.scintilla@unitn.it）。抽象的CRISPR-CAS技术已广泛扩展了植物育种中基因组编辑的应用领域，从而使遗传库中可能的特定和最小突变。关于标准基因组编辑技术，可以以核糖核蛋白（RNP）的形式引入CRISPR-CAS机械，从而避免将外源性DNA引入细胞中。对将无DNA递送到植物细胞中应用中的兴趣不断增加，尤其是在有价值的木本植物精英品种的情况下，CRISPR-CAS9技术将保留其基因型，同时仍导致靶向遗传修饰。通过确保CRISPR-CAS DNA-RNP作为RNP的无效递送，并且由于单个编辑的单元将不存在嵌合体，因此，使用CRISPR-CAS DNA-无需递送，非常适合新育种技术的需求。然而，通常通过低编辑效率和不成功的再生过程来阻碍木质植物中原生质体的细胞培养。深红色的L.胚胎愈伤组织。此策略符合无DNA策略要求。我们在这里描述了一种成功的无DNA方法，以获得完全编辑的葡萄植物，该方法是从V. vinifera cv获得的原生质体中再生的。在浓霉敏感性基因VVDMR6-2上编辑了转染的原生质体。再生的编辑植物表现出1bp或2bp的纯合缺失，以及1BP的纯合插入。引言基因组编辑技术允许以高度精确度修改细胞DNA。尤其是随着CRISPR-CAS9的出现（群集定期间隔短的短质重复 - CAS9）技术，基因组编辑的应用领域已被广泛扩展。该系统基于通过互补的RNA序列和CAS核酸酶介导的DNA双链破裂对DNA编辑位点的识别，这使得插入，缺失，甚至仅仅使一个核苷酸的修饰成为可能。因此，尤其是在木质植物遗传改善的情况下（例如葡萄藤或苹果）精英品种，CRISPR-CAS9技术可确保其基因型保存，同时导致靶向遗传修饰。CRISPR-CAS成分可以以核酸的形式引入细胞内（即DNA/mRNA编码整个系统），或以核糖核蛋白（RNP）复合物的形式进行编码。虽然DNA可以整合到基因组中，而mRNA受其内在不稳定性的影响，但RNP的直接细胞递送打开了有吸引力的场景，因为它有可能体现出强大的方法论，导致特定而最小的突变，而没有外源性DNA的痕迹（Woo等，2015）。从这种角度来看，与经典的转基因生物相比，对植物的应用兴趣可能会更好地接受消费者（Saleh等，2021）。到目前为止，已经提出了三种主要策略将CRISPR-CAS系统输送到植物细胞中。1）使用工程化的农杆菌，可以轻松克服植物细胞壁。然而，该策略采用外源质粒DNA，这些DNA含有农杆菌的DNA部分，在转化后，该策略在细胞DNA中积分为细胞DNA。对于木本植物，外源性DNA只能通过杂交去除，从而导致遗传背景的变化。成功地应用于包括木本植物在内的许多农作物的替代方法，包括T-DNA的分子切除（Dalla Costa等，2020），几乎完全去除外源性DNA。但是，剩余的最小残留外国DNA可能与许多国家的当前严格转基因生物法规不相容。2）粒子轰击使用装有生物材料的纳米颗粒子弹来射击植物组织，从而超过了细胞壁垒，并释放了纳米颗粒装载的生物货物以诱导基因组编辑。尽管如此，各种物理参数严重影响了这种方法的效率。，并非所有细胞都会被子弹击中，因此下游再生过程可能会引起嵌合植物。3）替代解决方案是暂时清除细胞壁，有效地将生物材料递送到单个细胞中。根据此策略，细胞壁是酶法消化的，因此提供了一个“裸”植物细胞（即原生质体）由质膜界定。在有利的条件下，可以通过PEG浸润，电穿孔或LiPofection轻松实现RNP的细胞递送。2-3天后，恢复了细胞壁，进一步的细胞划分