启动子。为了研究热诱导的indels是否是启动子特异性的,我们测试了三个常用的本构启动子35S,RPS5A和Zmubi以驱动Cas9表达[34-36]。我们筛选了每个启动子-CAS9组合的9-14独立分离T2种群,以两到四个不同的GRNA靶向PDS3。我们观察到3xHS处理后,PDS3表型的数量和/或严重程度增加了Zmubi-Cas9(6/9独立线),RPS5A-CAS9(14/14独立线),35S- Cas9(6/12独立线)和PCUBI-CAS9和PCUBI-CAS9(7/9 Independed Line Independent lineption;图S4)。尽管表型对于35S-CAS9线的表型相对温和,但我们的数据与其他报道相一致,即热应力会提高与驱动CAS9的启动子序列无关的ideel效率[17,18,26]。热休克提高了烟草中的基因组编辑效率
CRISPR/CAS9技术的应用已改变了我们针对基因组的指定区域和编辑指定区域的能力。对任何生物体的广泛适应性都导致了我们对许多生物过程的理解。许多当前的工具是为简单的植物系统设计的,例如二倍体物种,但是,农作物物种中有效的部署需要更大的编辑效率,因为这些效率通常包含多倍体基因组。在这里,我们检查了温度的作用,以了解CRISPR/CAS9编辑是否可以提高小麦的效率。最近发现,较高温度下的植物生长可能会增加突变率,该CAS9用小麦的两个不同启动子表达的CAS9进行了测试。增加组织培养或种子发芽和早期生长阶段的温度会增加小麦突变的频率,而Cas9酶是由Zmubi启动子驱动的,而不是Osactin驱动的。相比之下,由奥司蛋白启动子驱动的CAS9表达不会增加在转化线或转化过程本身中检测到的突变。这些结果表明,在多倍体谷物物种中,CRISPR/CAS9编辑效率可以显着提高,其生长条件的简单变化可以促进突变增加,从而创造了纯合子或无效的敲除。
(a)说明了ICCR2:Ruby和ICCR2质粒的方案。两个质粒都包括OSACT启动子(紫色)下的179个BAR基因和Zmubi 180启动子(绿色)下的GRF4-GIF1嵌合体。红宝石盒包括CYP76AD1,DODA和GT基因,181被2A肽隔开,均在CAM35S启动子下。lb和rb分别表示左侧和182个T-DNA区域的右边界。183(b)使用ICCR2(左)或ICCR2:Ruby(Ruby(右))转化小麦Calli(Ruby)的再生184(c)RT-PCR分析转基因T0植物的RT-PCR分析BAR(995 185 BP)和GRF4-GIF1(1233 bp)基因的BAR(995 185 BP); wt;野生型,PC;阳性对照(ICCR2质粒),NC; 186阴性对照(水)。187(d)用ICCR2(左)和ICCR2转换的转基因小麦线:Ruby(右)。Ruby在植物的所有部分中表达188,包括尖刺和根。189(e)大麦转型。用ICCR2:Ruby质粒转化导致红愈伤组织190但较低的再生(左),不含191的iCCR1:Ruby质粒的转化,不含191的Ruby质粒,含有GRF4-GIF1嵌合体,导致了高再生速率和转基因植物。192 193淘汰红宝石盒194