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电穿孔介导的牲畜受精卵基因组编辑
传统上，将基因组编辑试剂引入哺乳动物受精卵是通过细胞质或原核微注射完成的。这一耗时的过程需要昂贵的设备和高水平的技能。受精卵电穿孔提供了一种简化和更精简的方法来转染哺乳动物受精卵。有许多研究检查了小鼠和大鼠受精卵电穿孔中使用的参数。在这里，我们回顾了已报道的小鼠和大鼠的电穿孔条件、时间和成功率，以及关于牲畜受精卵（特别是猪和牛）的少数报道。在受精时或受精后不久引入编辑试剂可以帮助降低嵌合率，即个体细胞中存在两种或更多种基因型；引入核酸酶蛋白而不是编码核酸酶的 mRNA 也可以。嵌合在世代间隔较长的大型牲畜物种中尤其成问题，因为通过繁殖获得非嵌合的纯合后代可能需要数年时间。通过非同源末端连接途径实现的基因敲除已得到广泛报道，并且使用电穿孔成功实现的基因敲除比基因敲入更多。将大型 DNA 质粒递送到受精卵中会受到透明带 (ZP) 的阻碍，并且大多数通过电穿孔实现的基因敲入都使用短单链 DNA (ssDNA) 修复模板，通常小于 1 kb。在不使用细胞质注射的情况下，将长达 4.9 kb 的较大供体修复模板与基因组编辑试剂一起递送到受精卵中最有希望的方法是使用重组腺相关病毒 (rAAV) 与电穿孔相结合。但是，与用于递送成簇的规律间隔回文重复序列 (CRISPR) 基因组编辑试剂的其他方法类似，这种方法也与高水平的嵌合性有关。最近的研究成果是利用编辑过的生殖系能力细胞补充生殖系消融个体，从而避免基因组编辑创始系生殖系中出现嵌合现象。即使通过电穿孔介导将基因组编辑试剂递送至哺乳动物受精卵，基因组编辑流程中仍存在其他瓶颈，目前阻碍了非嵌合基因组编辑牲畜的可扩展生产。
简单的电穿孔即可在小鼠受精卵中实现高效的 CRISPR/Cas9 基因组编辑
受精卵电穿孔是小鼠中 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑中复杂的原核注射程序的快速替代方法。然而，目前的电穿孔方案要么需要投资专门的电穿孔仪，要么需要对受精卵进行腐蚀性预处理，这会损害胚胎的活力。在这里，我们描述了一种易于适应的方法，通过使用带有合成 CRISPR/Cas9 组件的普通电穿孔仪对完整的受精卵进行电穿孔，高效地在小鼠中引入特定突变，并且技术要求最低。该方案可有效处理来自各种遗传背景的受精卵，并与其他 CRISPR 核酸酶（如 Cas12a）兼容。
通过将 CRISPR/Cas9 系统电穿孔到体外受精的受精卵中有效生成 GGTA1 缺陷猪
背景：异种抗原是种间异种移植成功的主要问题。GGTA1 编码 α 1,3-半乳糖基转移酶，该酶对半乳糖基-α 1,3-半乳糖的生物合成至关重要，而半乳糖是导致超急性排斥的主要异种抗原。因此，GGTA1 修饰猪是猪对人异种移植的有希望的供体。在本研究中，我们开发了一种通过电穿孔将 CRISPR/Cas9 系统引入体外受精猪受精卵以生成 GGTA1 修饰猪的方法。结果：我们设计了五种针对 GGTA1 中不同位点的向导 RNA (gRNA)。通过电穿孔将 Cas9 蛋白与每一种 gRNA 一起引入后，评估了受精卵发育成的囊胚中的基因编辑效率。使用基因编辑效率最高的 gRNA 生成 GGTA1 编辑猪。在用 Cas9/gRNA 复合物转移电穿孔受精卵后，两头受体母猪产下六头仔猪。深度测序分析显示，六头仔猪中有五头在 GGTA1 的目标区域携带双等位基因突变，没有脱靶事件。此外，用异凝集素 B4 染色证实了 GGTA1 双等位基因突变猪的 GGTA1 功能缺陷。
一种无需体外处理受精卵的大片段敲入动物生产的新技术
AAVpro 包装质粒 (AAV2，#6234；AAV5，#6664；AA6，#6665，Takara Bio) 和 AAVpro 293T 细胞系 (#632273，Takara Bio)。所有 AAV 载体质粒均通过将对应于目标基因座和敲入序列的 PCR 片段克隆到 EcoRV 和 BglII 限制位点之间的 pAAV-CMV 载体中，去除 CMV 启动子、b-珠蛋白内含子和 hGH polyA 来构建。按照制造商的说明，使用 Xfect 转染试剂 (#631318，Clontech) 将 AAV 质粒和包装质粒转染 293T 细胞。使用 AAVpro 纯化试剂盒 (所有血清型) (#6666，Takara Bio) 提取和浓缩 AAV。使用 AAVpro 滴定试剂盒（#6233，Takara Bio）和热循环仪 Dice 实时系统 III（TP950，Takara Bio）估算病毒基因组拷贝数。
将受精卵注射到牛胚胎中，对自然发生的序列变异进行基因组编辑
基因组编辑通过有针对性地引入天然序列变体，加速遗传增益，为改进当前的牛育种策略提供了机会。这可以通过在修复模板存在的情况下利用编辑器诱导的基因组切割后的同源性定向修复机制来实现。将基因组编辑器引入受精卵并在胚胎中进行编辑的优势在于，活体动物的发育不会受到影响，并且与当代基于胚胎的改良实践保持一致。在我们的研究中，我们调查了引入已知的前黑素体蛋白 17 ( PMEL ) 和催乳素受体 ( PRLR ) 基因的序列变体，并产生完全转化为精确基因型的非嵌合体编辑胚胎的潜力。将 gRNA/Cas9 编辑器注射到牛受精卵中以将 3 bp 缺失变体引入 PMEL 基因，可产生高达 11% 的完全转化胚胎。使用 TALEN 后，转化率提高到 48%，但前提是通过质粒递送。在几种已知 PRLR 序列变体、不同修复模板设计和 DNA、RNA 或核糖核蛋白传递的背景下测试三种 gRNA/Cas9 编辑器，实现了高达 8% 的完全转化率。此外，我们还开发了一种基于活检的非嵌合体胚胎筛选策略，该策略有可能专门生产具有预期精确编辑的非嵌合体动物。
CRISPR/Cas9 介导的猪受精卵基因组编辑前的透明带处理
Abkowitz, JL、Persik, MT、Shelton, GH、Ott, RL、Kiklevich, JV、Catlin, SN 和 Guttorp, P. (1995)。大型动物造血干细胞的行为。美国国家科学院院刊，92 (6)，2031–2035。https://doi.org/10.1073/pnas.92.6.2031 Brinkman, EK、Kousholt, AN、Harmsen, T.、Leemans, C.、Chen, T.、Jonkers, J. 和 Van Steensel, B. (2018)。模板引导的 CRISPR/Cas9 编辑的简易量化。核酸研究，46 (10)，e58。 https://doi.org/10.1093/nar/gky164 Le, QA, Hirata, M., Nguyen, NT, Takebayashi, K., Wittayarat, M., Sato, Y., Namula, Z., Nii, M., Tanihara, F., & Otoi, T. (2020)。使用不同浓度的 Cas9 蛋白和靶向肌肉生长抑制素 (MSTN) 基因的 gRNA 进行电穿孔处理对猪受精卵发育和基因编辑的影响。动物科学杂志，91 (1)，e13386。 https://doi.org/10.1111/asj.13386 Li, R.、Liu, Y.、Pedersen, HS、Kragh, PM 和 Callesen, H. (2013)。猪单性生殖胚胎去除透明带后的发育和质量。Theriogenology，80 (1)，58–64。https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2013.03.009 Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., & Gerdts, V. (2012)。猪：人类传染病的模型。微生物学趋势，20 (1)，50–57。Nishio, K., Tanihara, F., Nguyen, T.-V., Kunihara, T., Nii, M., Hirata, M., Takemoto, T., & Otoi, T. (2018)。电穿孔过程中电压强度对体外生产的猪胚胎发育和质量的影响。家畜繁殖，53 (2)，313–318。https://doi. org/10.1111/rda.13106 Peng, H., Wu, Y., & Zhang, Y. (2012)。通过电穿孔将 DNA 和吗啉代诺西酮有效递送到小鼠植入前胚胎中。PLoS One，7 (8)，e43748。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043748 Peura, TT, & Vajta, G. (2003)。绵羊和牛核移植中现有方法与新方法的比较。克隆干细胞，5 (4)，257–277。 https://doi.org/10.1089/153623003772032772 Qin, W., Dion, SL, Kutny, PM, Zhang, Y., Cheng, AW, Jillette, NL, Malhotra, A., Geurts, AM, Chen, Y.-G., & Wang, H. (2015). 通过合子电穿孔核酸酶在小鼠中实现高效的 CRISPR/Cas9 介导基因组编辑。遗传学，200 (2), 423–430。 https://doi.org/10.1534/ Genetics.115.176594 Remy, S., Chenouard, V., Tesson, L., Usal, C., Ménoret, S., Brusselle, L., Hes- lan, J.-M., Nguyen, TH, Bellien, J., Merot, J., De Cian, A., Giovannangeli, C., Concordet, J.-P., &Anegon, I. (2017). 通过使用电穿孔将 CRISPR/Cas9 蛋白和供体 DNA 递送到完整受精卵中来生成基因编辑大鼠。科学报告，7 (1)，16554。https://doi.org/10。 1038/s41598-017-16328-y Tanihara, F.、Hirata, M.、Nguyen, NT、Sawamoto, O.、Kikuchi, T.、Doi, M. 和 Otoi, T. (2020)。通过将 CRISPR/Cas9 系统电穿孔到体外受精的受精卵中有效生成 GGTA1 缺陷猪。BMC Biotechnology，20 (1)，40。https://doi.org/10.1186/s12896-020-00638-7
水稻受精卵、成熟胚、未成熟胚再生植株突变的全基因组序列分析
通过全基因组测序，研究了由单个母株的合子、成熟胚和未成熟胚再生的水稻植株 (Oryza sativa L.，‘Nippon-bare’) 的体细胞克隆变异。还对母株和种子繁殖子代进行了测序。在子代中检测到了 338 个母株序列变异，平均值范围从种子繁殖植株的 9.0 到成熟胚再生体的 37.4。利用种子繁殖植株中的变异计算出的自然突变率为 1.2 × 10 –8，与之前报道的值一致。种子繁殖植株中变异的单核苷酸变异 (SNV) 比例为 91.1%，高于之前报道的 56.1%，且与再生体中的差异不显著。总体而言，如前所述，再生体中 SNV 的转换与颠换比率较低。成熟胚再生的植物的变异明显多于不同子代类型。因此，在水稻遗传操作过程中，使用受精卵和未成熟胚可以减少体细胞克隆变异。
水稻受精卵、成熟胚、未成熟胚再生植株突变的全基因组序列分析
通过全基因组测序，研究了由单个母株的合子、成熟胚和未成熟胚再生的水稻植株 (Oryza sativa L.，‘Nippon-bare’) 的体细胞克隆变异。还对母株和其种子繁殖子代进行了测序。在子代中检测到了 338 个母株序列变异，平均值范围从种子繁殖植株的 9.0 到成熟胚再生体的 37.4。利用种子繁殖植株中的变异计算出的自然突变率为 1.2 × 10 –8，与之前报道的值一致。种子繁殖植株中变异的单核苷酸变异 (SNV) 比例为 91.1%，高于之前报道的 56.1%，且与再生体中的差异不显著。总体而言，如前所述，再生体中 SNV 的转换与颠换比率较低。成熟胚再生的植物的变异明显多于不同子代类型。因此，在水稻遗传操作过程中，使用受精卵和未成熟胚可以减少体细胞克隆变异。
通过将CRISPR/CAS9系统电穿孔到Zygotes的一步生成多个基因编辑的猪，以减少异种抗原生物合成
摘要：异种抗原引起过度急性排斥并限制了种间异种移植的成功。因此，参与异种抗原生物合成的基因，例如GGTA1，CMAH和B4GALNT2，是改善异种移植结果的关键靶标。在这项研究中，我们引入了一种CRISPR/CAS9系统，同时使用电穿孔来靶向GGTA1，CMAH和B4GALNT2，以一步一代生成多个基因编辑的猪而没有异种抗原。首先，我们优化了针对GGTA1和CMAH的引导RNA（GRNA）相对于基因编辑的效率，并将电穿孔的胚胎与优化的GRNA和CAS9转移到受体Gilts中。接下来，当GGTA1，CMAH和B4GALNT2同时靶向GGTA1，CMAH和B4GALNT2时，我们优化了CAS9蛋白的浓度，并使用优化的条件同时靶向基因。我们实现了GGTA1 / CMAH双重编辑的猪和GGTA1 / CMAH / B4GALNT2三重编辑的猪的一步生成。免疫组织学分析表明异种抗原的下调。然而，这些多个基因编辑的猪是遗传镶嵌物，未能敲除一些异种抗原。尽管应解决镶嵌性，但电穿孔技术可能会成为旨在改善猪至人类异种移植的猪中一步生成多个基因修饰的主要方法。
优化电穿孔参数，使用 3 至 2000 kDA 的荧光葡聚糖将大分子有效递送至猪受精卵中
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