XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search SystemZymo
从淡水蜗牛组织中提取基因组DNA
基于自旋柱的DNA纯化试剂盒（例如Qiagen dneasy血液和组织试剂盒）一直是从包括腹足动物在内的各种生物体中提取基因组DNA的最爱。如前所述，这些套件的缺点是从某些样本类型（例如存储在乙醇中的样本类型）中可以实现的GDNA的数量和质量较低，但是在许多其他情况下，从其他样本类型中提取的GDNA可以很好地工作。可用的商业自旋柱套件的优点（例如Qiagen和Zymo品牌产品）是此过程中速度，易用性和缺乏有害化学物质的速度。蜗牛矢量工作组建议可以有效地使用几种基于自旋的柱子的试剂盒和方法，其中可以从新鲜组织中取出少量组织（例如部分头部脚），以避免过载和阻断旋转柱，并避免大量抑制物质的含量（请参阅Adema 2021）。此外，对于基于PCR的应用程序（甚至是扩增子面板），DNA质量和数量较低的DNA仍然适合使用，这些提供了一个不错的选择。注意，但是，使用Qiagen B＆T旋转柱套件提取的生物胶质蜗牛的基因组DNA产生了具有出色读取长度的PACBIO组件（Bollmann，OSU）。
DNA的DNA指纹识别日期棕榈（Phoenix dactilifera L.）...
抽象的日期棕榈（Phoenix dactylifera L.）是一种开花植物，以其可食用的甜果实而种植。这是一种具有单性花的雌雄同体的植物。在耕种中，需要大量的雌性树木，只有少量的雄性树木。然而，由于开花前的表型确定困难，需要4到5年，因此需要采取另一种遗传方法来减少这个问题。因此，进行了这项研究，以研究随机扩增多态DNA（RAPD）技术作为早期植物性别确定该植物的遗传工具的潜力。种植棕榈种子，直到种植年轻的叶子和嫩叶。DNA。使用六个不同的RAPD引物进行聚合酶链反应（PCR）扩增，并将所得的PCR产物在2％琼脂糖凝胶上解析2小时。使用凝胶上的带状模式将样品的结果与男性阳性对照进行比较。这项研究的发现清楚地表明，雄性和女幼苗之间的带状模式差异。因此，将RAPD用作指纹日期的常规遗传工具将有助于种植适当的雌性棕榈植物，从而减少时间浪费并增加投资回报率。关键字：日期棕榈；指纹；植物性别； RAPD
人类甲基化和非甲基化DNA集
产品描述人类甲基化和非甲基化的DNA集由两个对照DNA（非甲基化和甲基化）以及一组特定设计的引物，可与EZ DNA甲基化 - 甲基化 - 光点™结合使用，EZ DNA甲基化 - ez DNA甲基化基因甲基化基因甲基化基因，EZ DNA甲基化基因， Zymo研究以评估DNA的亚硫酸含量转化的效率。从包含DNA甲基转移酶DNMT1（ - / - ）和DNMT3B（ - / - ）1的细胞中纯化了人类HCT116 DKO非甲基化DNA。源自HCT116 DKO细胞的DNA具有低水平的DNA甲基化，可用作DNA甲基化分析的对照（图1）。人类HCT116 DKO甲基化的DNA被纯化为HCT116 DKO DNA，并且已在所有胞质位置进行了酶甲基化，该位置包括M.SSSI甲基转移酶2的CG二核苷酸，并可以用作DNA甲基化分析的阳性对照。在亚硫酸盐处理后，甲基化的胞嘧啶仍未转化（在哺乳动物中，胞嘧啶甲基化主要发生在CPG的情况下），而PCR后，非甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶并被检测为胸骨。DAPK1控制引物扩增了与死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）基因的甲基化，非甲基化和混合甲基化拷贝，并用于在甲硫酸盐转化对照DNA后用于使用。恢复的DNA非常适合许多应用，包括下游分析，例如PCR，限制性核酸内切酶消化，测序等。
血斑卡上动物粪便物质的 DNA 提取方案
159 图 2. 实验设置以确定适用于 DBS 的 DNA 提取和纯化方案 160。测试的不同方法是 DNA_P1) QIAsymphony® PowerFecal® Pro DNA 161 试剂盒（目录号 938036，Qiagen），包括在 FastPrep-24™ Classic 162 上以 6 m/s 的速度进行 6 轮均质化 162 60 秒，中间休息 5 分钟，然后用 163 蛋白酶 K 600 mAU/ml（Qiagen）消化，然后在 QIAsymphony® SP 164 机器人（Qiagen）上进行自动纯化。DNA_P2) 执行与 DNA_P1 相同，但不进行蛋白酶 K 处理。 DNA_P3) ZymoBIOMICS™ DNA Miniprep Kit (Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA) 经 FastPrep-24™ Classic 匀浆化后，以 6m/s 的速度匀浆 60 秒，共 6 轮，中间间隔 5 分钟。DNA_P4) MagNA Pure 96 DNA 和 Viral NA 小容量试剂盒在 MagNA Pure 96 仪器 (Roche, Basel, Switzerland) 上进行，采用蛋白酶 K 预处理步骤和标准缓冲液，使用针对双链 DNA 和下一代测序优化的 DNA Blood ds SV 方案。其中，DNA_P1、DNA_P2、DNA_P3 和 DNA_P4 用于从模拟物、空白和猪粪便中提取 DNA，DNA_P1 在所有研究动物的粪便上进行性能测试，此外还对阳性和空白对照进行了三份重复测试。使用 DNA_P1 从牛、马、犬、羊和猪的粪便中提取 DNA，并在 Illumina NovaSeq 上进行测序，从每个样本中生成 >2000 万个 PE 读数。这些数据集用于告知所需的测序工作量。
牛奶和奶制品中甲型流感病毒的提取和检测 - 2024 年 8 月 22 日
a. 95% 乙醇（Sigma E7023 或同等溶液） b. 不含 DNase/RNase 的水（Life Technologies AM9937 或同等溶液） c. 去离子水/蒸馏水/Milli-Q 水 d. NaCl（Sigma S3014 或同等溶液） e. NaOH（Sigma S5881 或同等溶液） f. HCl（Sigma H1758 或同等溶液） g. 甘氨酸（Sigma G7126 或同等溶液） h. 10X PBS 组织培养 (tc) 级（Sigma P5493）稀释至 1X i. KCl（Sigma P9541 或同等溶液） j. 磷酸二氢钾（Sigma P9791 或同等溶液） k. 磷酸氢二钠（Sigma S5011 或同等溶液） l. 甘油（Sigma G5516 或同等溶液） m.无 DNase/RNase 微量离心管，不粘连、低吸附、硅化 0.5 ml（Life Technologies AM12350 或同等产品） n. 无 DNase/RNase 微量离心管 1.5 ml，不粘连、低吸附、硅化（Life Technologies AM12450 或同等产品） o. 无 DNase/RNase 微量离心管 2.0 ml，不粘连、低吸附、硅化（Life Technologies AM12475 或同等产品） p. 过滤屏障防气溶胶微量移液器吸头，无 DNase/RNase（0.2 – 1000 µl） q. Qiagen QIAamp 病毒 RNA 小量试剂盒（Qiagen 52904） r. Qiagen 收集管（Qiagen 19201） s. OneStep™ PCR 抑制剂去除试剂盒（Zymo Research D6030） t. 2.0 mL 微量离心管，不含 DNase/RNase（USA Scientific 1620-2799 或同等产品） u. OneStep RT-PCR 试剂盒（Qiagen 210210 或 210212） v. Ambion Superase·In RNase 抑制剂（20 单位/µl）；Life Technologies AM2694 (2,500 U) 或 AM2696 (10,000 U) w. Eppendorf DNA LoBind Tubes 5.0 mL Fisher Scientific 0030108310 或同等产品 x. 15 ml 聚丙烯锥形管（Fisher Scientific 14-959-70C 或同等产品） y. 50 mM MgCl 2（BioRad 1708872 或同等产品）或 25 mM MgCl 2（ThermoFisher Scientific AB0359 或同等产品）z.内部对照 RNA（BioGX 目录号 750-0001 - 联系公司）aa. 所有 RTqPCR 检测的标准脱盐引物和 HPLC 探针（Integrated DNA Technologies 或同等公司）bb. RT-qPCR 阳性对照（甲型流感病毒的定量基因组 RNA
碱基编辑酶 APOBEC3A 以低效率和高选择性催化 RNA 中的胞嘧啶脱氨
A3A 和 eA3A 表达。A3A 表达构建体 (Addgene #109231) 之前已有描述，可用于纯化 A3A 作为融合蛋白 (MBP-A3A-His)，可进一步加工以生成分离的 A3A 结构域。32,33 对于 eA3A (A3A-N57G)，N57G 突变是通过 Q5 定点诱变 (New England Biolabs, NEB) 引入的。A3A 和 eA3A 构建体的细菌表达之前已有详细描述。 33 将纯化的 MBP-A3A-His、MBP-eA3A-His 或分离的 A3A 在 50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、50 mM NaCl、10% 甘油、0.5 mM DTT 和 0.01% Tween-20 中透析过夜，并使用 BSA 标准曲线确定蛋白质浓度。基于 SwaI 的脱氨酶对 ssDNA 和嵌合底物的活性。5'-荧光素 (FAM) 荧光标记的底物 S35-dC 或具有单个靶核糖胞嘧啶的匹配底物（在其他 DNA 骨架中）（S35-rC）由 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成，以及相关产品对照（S35-dU 和 S35-rU）。在最佳 A3A 反应条件（最终为 20 mM 琥珀酸：NaH 2 PO 4：甘氨酸 (SPG) 缓冲液 pH 5.5，0.1% Tween-20）下，用 6 倍稀释的未标记 A3A（从 1 µM 到 4 pM）处理 100 µM 寡核苷酸。反应在 37 ˚C 下进行 30 分钟，然后终止（95 ˚C，10 分钟）。然后加入 200 nM 互补链并退火。加入 SwaI (NEB)，在室温下消化过夜。加入甲酰胺上样缓冲液，样品加热变性（95 ˚C，20 分钟），然后在 50 ˚C 下在 20% 变性 TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶上运行。使用 Typhoon 成像仪（GE Healthcare）上的 FAM 滤光片对凝胶进行成像。使用 ImageJ 中的面积量化工具进行定量分析。720 碱基对 ssDNA 底物的合成。为了生成 ssDNA，使用 720 bp gBlock 基因片段 (IDT) 作为模板 (补充图 2a)，并使用 Taq 聚合酶 (NEB) 进行扩增，采用指数后线性 (LATE) PCR 反应方案，该方案采用相对于磷酸化的反向引物过量的正向引物。32 对反应物进行纯化 (NucleoSpin、Fisher)，然后在 37 ˚C 下用 核酸外切酶处理 1 小时以降解磷酸化链，然后进行热失活 (90 ˚C，10 分钟)。然后将产物在 2% 琼脂糖凝胶上运行，并使用凝胶 DNA 回收试剂盒 (Zymoclean) 回收 ssDNA。通过乙醇沉淀进一步纯化 ssDNA，并使用 Qubit ® 荧光计 (ThermoFisher) 测量其浓度。对于一个重复，ssDNA 以大分子寡核苷酸 (IDT) 的形式获得，并通过乙醇沉淀进一步纯化。720 聚体 RNA 底物的合成。使用 720 bp 基因块 (IDT) dsDNA 作为模板，在推荐条件下使用 TranscriptAid Enzyme Mix (ThermoFisher) 通过体外转录生成 RNA，并在 37 ˚C 下孵育两小时。然后通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化 RNA。将样品重新悬浮在无核酸酶的水中，并进一步用 MspI、XbaI 和 AclI 限制性酶 (NEB) 处理以消化任何剩余的 DNA 模板。在 37 ˚C 下孵育 1 小时后，使用 RNA Clean and Concentrator-5 试剂盒 (Zymo Research) 纯化 RNA。为了进一步确保完全去除模板 DNA，在 37 ˚C 下用 DNase I (Ambion) 处理 RNA 30 分钟。重复纯化 (RNA Clean and Concentrator-5)，并使用 Qubit ® 荧光计测量纯化 RNA 的浓度。通过“预测二级结构网络”预测 720 聚体中几个中尺度区域的二级结构
全基因组测序和分析 - Illumina
全基因组测序和分析 - 基于 Illumina Rhabdoid (RT) Illumina 基因组板的文库构建（350-450bp 插入大小）：将 96 孔格式的 2ug 基因组 DNA 通过 Covaris E210 超声处理 30 秒进行碎裂，使用 20% 的“占空比”和 5 的“强度”。双端测序文库是按照 BC 癌症机构基因组科学中心 96 孔基因组 ~350bp-450bp 插入 Illumina 文库构建协议在 Biomek FX 机器人（Beckman-Coulter，美国）上准备的。简单来说，DNA在96孔微量滴定板中用Ampure XP SPRI 珠子纯化（每60uL DNA 40-45uL 珠子），在单一反应中分别用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行末端修复和磷酸化，然后用Ampure XP SPRI 珠子进行清理，并用Klenow片段（3'到5'外显子减去）进行3' A加尾。用Ampure XP SPRI 珠子清理后，进行picogreen定量以确定下一步接头连接反应中使用的Illumina PE接头的数量。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化接头连接产物，然后使用 Illumina 的 PE 索引引物组，用 Phusion DNA 聚合酶（美国赛默飞世尔科技公司）进行 PCR 扩增，循环条件为：98˚C 30 秒，然后 6 个循环，98˚C 15 秒，62˚C 30 秒，72˚C 30 秒，最后在 72˚C 延伸 5 分钟。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化 PCR 产物，并使用高灵敏度分析（美国珀金埃尔默公司）用 Caliper LabChip GX 检查 DNA 样本。所需大小范围的 PCR 产物经过凝胶纯化（在内部定制机器人中使用 8% PAGE 或 1.5% Metaphor 琼脂糖），并使用 Agilent DNA 1000 系列 II 检测和 Quant-iT dsDNA HS 检测试剂盒使用 Qubit 荧光计（Invitrogen）评估和量化 DNA 质量，然后稀释至 8nM。在使用 v3 化学法在 Illumina HiSeq 2000/2500 平台上生成 100bp 配对末端读数之前，通过 Quant-iT dsDNA HS 检测确认最终浓度。全基因组亚硫酸盐-Seq 文库构建和测序：使用 1-5 mg Qubit（Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德）定量基因组 DNA 进行文库构建，如所述（Gascard 等人，2015 年）。为了追踪亚硫酸盐转化的效率，将 1 ng 未甲基化的 lambda DNA (Promega) 掺入使用 Qubit 荧光法定量的 1 µg 基因组 DNA 中，并排列在 96 孔微量滴定板中。使用 Covaris 超声处理将 DNA 剪切至 300 bp 的目标大小，并使用 DNA 连接酶和 dNTP 在 30o C 下对片段进行末端修复 30 分钟。使用 2:1 AMPure XP 珠子与样品比例纯化修复后的 DNA，并在 40 µL 洗脱缓冲液中洗脱以准备 A 尾；这涉及使用 Klenow 片段和 dATP 将腺苷添加到 DNA 片段的 3' 端，然后在 37o C 下孵育 30 分钟。用磁珠清理反应后，将胞嘧啶甲基化双端接头（5'-AmCAmCTmCTTTmCmCmCTAmCAmCGAmCGmCTmCTTmCmCGATmCT-3' 和 3'-GAGmCmCGTAAGGAmCGAmCTTGGmCGAGAAGGmCTAG-5'）在 30oC 下连接到 DNA 20 分钟，并纯化接头两侧的 DNA 片段珠。在亚硫酸盐转化之前，用 10 个 PCR 循环扩增一份文库片段，并在 Agilent Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 芯片上进行大小测定。扩增子的长度在 200-700 bp 之间。使用 EZ Methylation-Gold 试剂盒（Zymo Research）按照制造商的方案实现甲基化接头连接的 DNA 片段的亚硫酸盐转化。五次循环
ORS 2025 年会论文第 220 号
ssouth@uoregon.edu 披露：Sanique South (N)、Yan Carlos Pacheco (N)、Levi Wood (N)、Nicholas Hannebut (N)、Cindy Brawner (N)、Matlock Jeffries (N)、Nick Willett (N) 简介：全球有数百万人患有创伤后骨关节炎 (PTOA)，它是美国导致残疾的主要原因之一。此外，目前尚无已知的治愈方法或疾病改良疗法来阻止 PTOA 进展。细胞疗法在临床前研究中通常显示出巨大的潜力；然而，临床试验显示结果差异很大。这种差异被认为部分来自供体之间细胞效力的高度异质性以及宿主环境的多变性。了解供体人类间充质细胞 (hMSCs) 的可靠性和效力是确保 PTOA 获得一致和优化的治疗结果的关键步骤。 DNA 甲基化和去甲基化在调节 MSC 再生和免疫调节中发挥作用。然而，甲基化在 MSC 调节中的确切作用，以及基线表观遗传模式是否有助于预测关键治疗特性尚不完全清楚。为了弥补这些知识空白，本研究旨在基于基线表观遗传特征和结构结果建立供体 hMSC 治疗效力的预测模型，以研究可修改的细胞靶点，确保细胞治疗获得更好且一致的治疗结果。我们假设，与预测的治疗效果较差的 hMSC 相比，预测的治疗性 hMSC 将表现出独特的表观遗传特征。方法：体外研究：从 RoosterBio 和 Lonza 购买骨髓衍生的 hMSC。将来自 12 位供体的 hMSC 培养 24 小时（RoosterNourish TM -MSC 培养基，RoosterBio；MSCGM™ 间充质干细胞生长培养基，Lonza）。收获细胞并使用 Qiagen DNEasy 试剂盒提取 DNA。DNA 经过亚硫酸盐转化（每个样本 500ng，Zymo EZ DNA 甲基化试剂盒），然后加载到 Illumina Infinium HumanMethylation EPIC 阵列上，该阵列可以量化整个基因组中的 >850,000 个 CpG 位点，包括外显子、内含子和基因间区域。使用 R（v. 4.4.0）进行统计分析。使用 ChAMP 包（v.3.14）加载和处理原始 .IDAT 文件。首先加载原始阵列数据，并将 CpG 位点甲基化数据转换为 beta 值（0-1 甲基化值估计值表示给定 CpG 位点甲基化与未甲基化探针强度之比）。然后使用默认选项的 champ.norm 函数使用 beta 混合分位数归一化程序对 beta 值进行归一化。排除以下情况：（1）检测 P ≥0.01 的探针、针对非 CpG 位点的探针、位于性染色体上的探针，以及在CpG 探针 3' 端 5bp 范围内具有已知单核苷酸多态性的探针，其次要等位基因频率≥1％ [1] (N=158,841)。对于模型开发，使用具有自动特征选择的 glmnet 包 (v. 2.0-16) 开发了弹性网络正则化广义逻辑模型。通过 3 倍内部交叉验证调整模型，并记录性能特征。由于发现几个 CpG 位点是再生能力的完美预测因子，我们随后执行了逐步减少数据集的方法，其中，在每一轮开发之后，从数据集中删除最终模型中包含的特征并重新进行开发，总共 50 轮开发周期。所有 50 轮中的所有模型都表现完美（AUC=1.0），可能是因为样本量相对较小而过度拟合。使用在 MATLAB（Mathworks）中生成的 PLSDA 和 PLSR 模型来识别治疗性 hMSC，并使用分泌的细胞因子水平读数作为独立变量，以不同的 hMSC 供体/治疗作为二元结果变量，对来自初始体外研究的 z 分数数据进行训练。使用已建立的内侧半月板横断面 (MMT) 临床前大鼠模型，在 PTOA 的体内临床前模型中验证了预测的治疗性 hMSC（图 1A）。结果：初步研究的数据用于训练 PLSR 预测统计模型。预测模型预测前瞻性地揭示了沿 LV 轴 1 分离的大约六个供体的 hMSC，预测与治疗效果相关，从而预测治疗效果较差和治疗效果较强的供体；因此，6 个样本被指定为可能的“反应者”，6 个被指定为可能的“无反应者”（图 1B）。在甲基化分析中，我们发现在 50 轮开发周期中选定了 119 个 CpG 位点。所有位点均存在显著差异甲基化（P 值 7.5E-8 至 4.1E-4）。与无反应者相比，应答者中大约一半的 CpG 为高甲基化（n=45），其余为低甲基化（n=43）。应答者与无反应者之间平均甲基化值差异最大（Δβ 最高）的 CpG 位点包括 cg14705220（Δβ=0.25 应答者-无反应者 [应答者高甲基化]，P =4E-4）和 cg09382002（Δβ=-0.23，P =3E-4 [应答者低甲基化]），图 2。然后，我们对与这些差异甲基化位置相关的基因进行了通路分析。 119 个 CpG 定位到 88 个已知基因。这些基因在 T 细胞信号转导（IL-7 信号转导通路，P =2.27E-3）、吞噬细胞：NK 细胞相互作用（IL-15 产生，P =8.13E-3）和 B 细胞信号转导（April 介导信号转导 P =8.69E-3、B 细胞活化因子信号转导 P =9.09E-3）中的重要通路中富集。有趣的是，差异甲基化基因组位置中富集程度最高的基因网络集中在几个已知的 OA 效应物周围，包括 NFkB 复合物、组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 和机械感受器 (TRPV1) 等 (图 3)。讨论：甲基化数据结果支持了我们的假设，即预测的治疗性 hMSC 将表现出独特的表观遗传特征。我们的数据表明，基于来自 hMSC 的混合细胞 DNA 甲基化数据的模型可以很容易地区分可提供治疗益处的细胞产品和不会提供治疗益处的细胞产品。这些差异甲基化模式中涉及的基因在先前在 OA 中描述的途径中富集。意义/临床意义：DNA 甲基化分析可能有助于在膝关节 OA 关节内注射前筛选 hMSC 供体，以最大限度地提高临床益处。此外，进一步研究我们发现的驱动表观遗传差异的个体细胞亚群可能会揭示出可用于开发未来膝关节 OA 疗法的新途径。致谢：本研究得到了俄勒冈州吴仔人类表现联盟的支持。