魔术 - 晶体:在异质样品中稀缺大分子的结构性确定Yasuhiro arimura 1,2*,hide A. Konishi 1,Hironori funabiki 1* 1* 1 1* 1 1* 1个伪装体和细胞生物学实验室,纽约州纽约州立大学,纽约州纽约州立大学。中心,美国华盛顿州西雅图市,98109-1024 *通信:funabih@rockefeller.edu,yarimura@rockefeller.edu或yarimura@fredhutch.org摘要冷冻冷冻级单 - 单点分析通常需要在0.05〜5.5.5.0 mg/ml上达到目标Macromolecule浓度,以下是iSMACromolecule浓度。在这里,我们设计了磁隔离和浓度(魔术)-cryo-em,这是一种能够对磁珠上捕获的靶标的直接结构分析,从而将目标的浓度需求降低到<0.0005 mg/ml。将魔术 - 晶体EM适应染色质免疫沉淀方案,我们表征了连接器组蛋白H1.8相关的核小体的结构变化,这些核小体是从异叶鸡蛋提取物中的相间和中期染色体分离出来的。将重复的选择组合以排除垃圾颗粒(Duster),这是一种去除低信噪比粒子颗粒的粒子策划方法,我们还解决了H1.8结合的核纤维蛋白NPM2的3D冷冻EM结构与与跨相染色体和露出不同的敞开和封闭的结构变体的3D冷冻EM结构。我们的研究表明,魔术 - 晶体EM对异质样品中稀缺的大分子的结构分析的实用性,并为H1.8与核小体关联的细胞周期调节提供了结构见解。关键字冷冻EM,磁珠,Xenopus鸡蛋提取物,核小体,接头组蛋白H1,核纤维蛋白
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证(未经同行评审证明)获得的是作者/资助者,他授予Biorxiv授予Biorxiv的许可,以永久显示预印本。这是该版本的版权持有人,该版本发布于2025年1月8日。 https://doi.org/10.1101/2024.01.21.576499 doi:Biorxiv Preprint
摘要:合成微生物联合体在生物技术应用方面具有巨大潜力。然而,由于竞争动态和物种间生长速度不平衡,实现稳定且可重复的共培养具有挑战性。本文,我们提出了一种有效的微生物包封方法,该方法基于涂有 ε-聚-L-赖氨酸 (εPLL-HB) 的海藻酸盐基核壳水凝胶珠。该方法可确保微生物完全封闭,同时允许特征差异很大的几种微生物在珠内持续生长。与壳聚糖和 α-聚-L-赖氨酸(两种最常用的此类包封包覆剂)相比,εPLL 在避免细胞在不同培养条件下和所有测试的微生物菌株逃逸方面表现出优异的性能,同时允许它们在胶囊内增殖。εPLL-HB 能够构建空间组织的共培养,有效地平衡不同生长速度的微生物之间的种群。此外,εPLL-HB 可防止木质纤维素衍生介质中的有毒化合物,并在 -80°C 长期储存后仍能保持其包封效果和活力。εPLL-HB 具有出色的微生物控制、结构完整性和耐化学性,再加上价格低廉和易于制备,使其成为设计合成微生物联合体的多功能工具,在生物技术过程中具有广泛的适用性。
引言植物组织培养是一种无菌技术,用于快速对健康,无病原体和真实型植物的微繁殖。1目前,在商业植物组织培养实验室中常规大量批量生产及其方案是通过器官发生或胚胎发生建立的。然而,这种方法仍然面临一些局限性,例如微繁殖过程的耗时性质和每个生产的植物的成本高成本。导致成本增加的主要因素是劳动力,材料和化学物质。2此外,许多小型文化船的清洁,归档和处理需要更多的时间和劳动。此外,在适应和转移到土壤期间可能会丢失一些植物。已努力降低成本并提高再生植物的质量和数量。3最有希望的方法是光自养微繁殖(带有无琼脂培养基)和生物反应器。琼脂是昂贵的成分之一,它被添加为胶凝剂,用于凝固培养基并防止外植体浸没。在植物组织培养中测试了不同的支撑矩阵作为琼脂的替代品,例如木薯粉,玉米粉,煮土豆,
寡核苷酸耦合的dynabeads™磁珠用于从生物样品中特异性捕获核酸靶标(图3)。在等离子体(400 µL最终体积)中峰于M13噬菌体的已知量(1.4x10^5 pfu)后,样品被液化,并通过杂交在寡聚偶联的珠子偶联物上捕获的释放的核酸靶标。然后从珠子中洗脱核酸靶标,并通过qPCR定量。当裂解/结合步骤仅在室温下长2分钟时,回收率约为25%,但是当裂解/结合时间增加到10分钟并在55ºC处发生时,恢复速率达到70%,表明根据捕获效率要求,测定条件可以调节(图4)。
记录的版本:该预印本的一个版本于2021年10月16日在国际高级制造技术杂志上发布。请参阅https://doi.org/10.1007/s00170-021-08155-3。
(未经同行评审认证)是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2020 年 3 月 4 日发布。;https://doi.org/10.1101/2020.03.03.970251 doi:bioRxiv preprint
注意:此处提供的Spriselect或Nebnext样品纯化珠的体积可与此步骤中的精确缓冲液中包含的样品一起使用(71.5 µL;步骤1.2.5。)。也可以使用Ampure XP珠。如果使用Ampure XP珠,请在使用前至少30分钟将珠子温暖至室温。这些珠子量可能无法正常工作以在工作流程的不同步骤中进行清理,或者在此步骤中是第二个清理。对于在不同缓冲条件下包含的样品的清理,可能需要实验确定体积。
图6用于尿β2-微球蛋白结合珠的免疫印迹,该珠子用抗β2-微球蛋白抗体固定的铜离子。Naito等人描述了用铜离子固定的珠子的制备。[26]。用磷酸盐缓冲盐水稀释10倍的尿素的二十微升珠子(PBS:150 mM NaCl,20 mM磷酸钠; pH 7.2)。将混合物在4°C旋转30分钟,然后在4°C下以16,000×g离心5分钟。颗粒珠3次。铜结合蛋白从珠子中释放出来,由十二烷基硫酸钠变性,然后受到十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳的影响,然后用抗-β2-微球蛋白抗体进行免疫印迹。箭头指示在尿素样品中检测到的三种不同类型的糖基化β2-微球蛋白。m表示标记蛋白。
10 毫克片剂:速释 10 毫克片剂(可分割)。圆形、扁平、白色片剂,边缘略有斜角,内含 10 毫克哌甲酯。片剂直径约为 7 毫米,一面印有 CG,另一面印有 A/B,有刻痕。LA 胶囊 10 毫克:缓释硬胶囊。浅棕色和白色胶囊中装有白色至灰白色珠子,印有棕褐色墨水印有 NVR 和 R10。LA 胶囊 20 毫克:缓释硬胶囊。白色胶囊中装有白色至灰白色珠子,印有棕褐色墨水印有 NVR 和 R20。LA 胶囊 30 毫克:缓释硬胶囊。黄色胶囊中装有白色至灰白色珠子,印有棕褐色墨水印有 NVR 和 R30。LA 胶囊 40 毫克:缓释硬胶囊。浅棕色胶囊中装有白色至灰白色珠子,上面用棕褐色墨水印有 NVR 和 R40 字样。LA 胶囊 60 毫克:缓释硬胶囊。浅棕色胶囊中装有白色至灰白色珠子,上面用棕褐色墨水印有 NVR 和 R60 字样。