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DNA双链断裂修复途径的选择与调控
图 1 DSB 修复途径总览 .DSB 发生后 , Ku70-80 会最先结合上来 , 如果不发生末端切除 , 会继而招募 DNA-PKcs, ligase IV, XRCC4 等 cNHEJ 核心因子介导 cHNEJ 修复途径 .如果末端发生 MRN-CtIP 介导的末端切除 , 则会产生 ssDNA 抑制 cNHEJ 修复途 径 .短程切除和长程切除产生的 ssDNA 可以通过链内退火进行修复 , 分别被称为 alt-EJ 和 SSA.长距离切除产生的 ssDNA 也可以 在 BRCA2-PALB2-BRCA1 复合体的帮助下和 RAD51 形成核蛋白纤维 , 进行同源找寻和连入侵过程 , 从而进入 HR 修复途径 .HR 途径又可以分为 BIR, SDSA 和 DSBR Figure 1 Overview of DSB repair pathways.The broken ends are first recognized and bound by Ku70-80.Without end resection, other cNHEJ core factors, such as DNA-PKcs, ligase IV, XRCC4, would be recruited to DSBs to mediate cNHEJ pathway.When MRN-CtIP-mediated resection occurs, the generated ssDNA will inhibit cNHEJ pathway.ssDNA from short-range and long-range resection can anneal in-strand to resolve the damages, termed Alt-EJ and SSA, respectively.ssDNA from long-range resection can also be bound by RAD51 to form nucleoprotein filament under the help of BRCA2-PALB2-BRCA1 complex.Nucleoprotein filament carry out homologous searching and strand invasion, promoting HR pathway.The HR pathway could be divided into BIR, SDSA and DSBR
非同源末端连接是 CRISPR/Cas 的关键……
尽管成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 (Cas) 介导的基因编辑已经彻底改变了生物学和植物育种，但大规模的可遗传植物染色体重组仍处于起步阶段。现在可以实现染色体内的重复和倒位，以及染色体之间的易位。随后，可以破坏或新建遗传连锁。此外，染色体上基因的顺序也可以改变。虽然自然染色体重组在减数分裂过程中通过同源重组发生，但 CRISPR/Cas 介导的染色体重排最好通过利用体细胞中的非同源末端连接 (NHEJ) 途径获得。NHEJ 可细分为经典 (cNHEJ) 和替代 NHEJ (aNHEJ) 途径，它们部分地以拮抗方式运作。 cNHEJ 通路不仅可以保护断裂的 DNA 末端免于降解，还可以抑制先前未连接的断裂末端的连接。因此，在没有 cNHEJ 的情况下，可以获得更多的倒位或易位，这可以归因于无限制地使用 aNHEJ 通路进行双链断裂 (DSB) 修复。与倒位或易位相反，短串联重复可以通过 Cas9 切口酶由成对的单链断裂产生。有趣的是，cNHEJ 通路对于这些类型的重复至关重要，而 aNHEJ 则是补丁插入所必需的，补丁插入也可以在 DSB 修复期间形成。由于染色体工程不仅在模式植物拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 中实现，而且在作物玉米 (Zea mays) 中也实现，我们预计这项技术将很快改变育种过程。
经典和替代最终连接的不足
在真核生物中，双链断裂（DSB）可以通过同源重组（HR）或非同源最终连接（NHEJ）修复。在体细胞中，人力资源非常不具体。因此，绝大多数DSB通过NHEJ的两种不同途径进行修复。经典（CNHEJ）途径取决于het-rodimer ku70/ku80，而聚合酶theta（polq）（polq）是替代（anhej）途径的核心。令人惊讶的是，即使两种途径受损，拟南芥植物也是可行的。但是，它们表现出严重的生长迟缓和生育能力降低。有丝分裂过轴酶的分析表明，双突变体的特征是由于DSB修复缺陷而导致染色体碎片的急剧增加。与单个突变体相反，发现双突变体对诱导DSB的基因毒素博来霉素高度敏感。因此，这两种途径都可以在DSB修复中相互补充。我们推测，在没有NHEJ途径的情况下，HR可能会增强。这对于基因靶向（GT）特别有吸引力，其中使用同源模板引入了预定的变化。不期望的是，与野生型植物相比，POLQ单突变体和双突变体的GT频率明显较低。因此，我们能够证明消除两种NHEJ途径并不对农业介导的GT构成有吸引力的方法。但是，我们的结果清楚地表明，CNHEJ的损失导致GT频率的增加，这对于使用Planta GT策略的实践应用特别有吸引力。
CRISPR–Cas9 介导的拟南芥可遗传染色体易位的诱导
成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) - CRISPR 相关蛋白 (Cas) 技术已应用于植物育种，主要用于改良单个或多个性状的基因 1 – 4 。本文我们表明，这项技术还可用于重组植物染色体。利用来自金黄色葡萄球菌 5 的 Cas9 核酸酶，我们能够在拟南芥中诱导异源染色体之间 Mbp 范围内的相互易位。值得注意的是，在没有经典的非同源末端连接途径的情况下，易位频率大约高出五倍。利用 Cas9 核酸酶的卵细胞特异性表达和连续的批量筛选，我们能够分离可遗传事件并建立易位纯合的品系，单个品系的频率高达 2.5%。通过分子和细胞学分析，我们证实了在拟南芥 1 号和 2 号染色体之间以及 1 号和 5 号染色体之间获得的染色体臂交换是保守的和相互的。诱导染色体易位可以有针对性地模拟基因组进化或染色体修改，固定或打破不同染色体上性状之间的遗传连锁。植物基因组的受控重组有可能改变植物育种。鉴于养活快速增长的人口的挑战以及气候变化对农业的影响，对新作物品种的需求日益增加。随着传统育种已达到极限，使用基因组编辑工具对作物进行理想性状改造正成为主要关注点 6 。应用 CRISPR-Cas 系统定向诱导位点特异性双链断裂 (DSB) 使得基因编辑既可用于植物基础研究，也可用于农业性状的产生和改良 7 。在包括植物在内的多细胞真核生物中，DSB 的修复主要由两种途径介导，非同源末端连接 (NHEJ) 和同源重组 8 。通过易错的 NHEJ 进行的修复通常与断裂位点处的序列信息丢失有关，而同源重组主要导致无错修复 9 。在植物中，NHEJ 是体细胞组织中普遍的修复途径。NHEJ 可进一步细分为经典 NHEJ (cNHEJ) 和替代 NHEJ (aNHEJ) 途径 10 。在 cNHEJ 的情况下，断端直接重新连接，有时会导致断裂位点处的小插入或缺失 (indel)。aNHEJ 利用靠近断裂位点的微同源性并依赖于聚合酶 theta，导致与插入部分相关的微同源性之间的序列信息缺失 11,12 。一次诱导多个 DSB 可以通过 NHEJ 将不相关的断裂末端连接起来，从而导致基因组中复杂的重排。