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cas9在马拉维仙都是astatotilapia calliptera
丽鱼科鱼是这种适应性辐射的教科书示例。它们是包含2200多种物种的最富含物种的脊椎动物家族之一，它们表现出非凡的形态，生理和行为变化[2-4]。大多数物种（大约2000）在东非湖泊，坦any尼卡，维多利亚和马拉维发现。仅马拉维湖就有800多种在过去的80万年中出现的[4,5]。它们在身体形状，颅面骨骼，下颌设备，侧线系统，大脑，视力和色素沉着表型等方面显示出广泛的形态变化[6-13]。尽管它们的形态多样性，但马拉维酸硅酸盐物种对之间的平均序列差异仅为0.1 - 0.25％，因此在这个湖中，不同的表型的演变似乎是通过相对较小的遗传变化而发生的[5,14]。它们的遗传相似性可以实现种间杂交，可用于定量性状基因座分析，以发现物种特异性性状变异的基因。这是由于它们对实验室和近年来提供的基因组资源财富的能力所支持的，其中包括许多代表性的参考基因组[15]。尽管上述工具有助于发现与性状多样化相关的基因座，但只能通过通过基因组编辑来测试候选基因功能来实现因果关系证明。A. Calliptera占据了包括马拉维湖在内的栖息地，以及外围河流和湖泊[16]。在这里，我们报告了CRISPR/CAS9在Cichlid Astatotilapia calliptera中生成编码和非编码序列突变体的应用，这是一种母体的喉咙毛毛类鱼，这是马拉维单倍蛋白辐射的一部分。系统发育分析表明，所有马拉维酸菊酯物种都可以分为七个生态形态组，这是由三种独立的丽鱼辐射造成的，这些裂解源自源自通才的astatotilapia-型祖先谱系[5]。因此，A。Calliptera是一个有用的模型，在该模型中开发功能工具来探索马拉维纯粹的丽鱼科学物种形成和适应性（图1）。我们专门针对一个A. Calliptera人口，来自马拉维湖以北的一个小火山口湖（图1A），在文献中称为Masoko湖（德国殖民地管理局使用），并在当地被称为Kisiba湖[17]。来自Masoko/Kisiba的Astatotilapia calliptera处于适应性差异的早期阶段，其中两个不同的生态形态在身体形状，饮食，营养形态和身体着色（图1 B）上也有所不同（图1 B），也使其成为研究早期概况阶段的理想系统。重要的是，A。Calliptera具有高质量的参考基因组，并且适合实验室环境。他们有一个8 - 12个月的生成时间，以非季节性的方式容易繁殖，允许一年一度的鸡蛋收集用于基因编辑和胚胎发育研究。我们选择为相对良好的特征性基因眼皮白化病（OCA2）生成突变体，因为它具有易于可见的表型，其中黑色色素产生（黑色素）受损，从而使早期的胚胎阶段从哪个
基于CRISPR/Cas9 的激活系统研究进展
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CRISPR/CAS9用于害虫管理
摘要：害虫对农业生产力构成了严重威胁。最初，对于有害生物，采用了几种繁殖方法，这些方法现在已被基因组编辑（GE）策略逐渐取代，因为它们更有效且辛苦。crispr/cas9（定期间隔间隔短的单位重复/CRISPR相关系统）被发现是细菌的适应性免疫系统，并且随着科学的进步，它已被即兴创作成革命性的基因组编辑技术。由于其特定的且易于处理，基于CRISPR/CAS9的基因组编辑已应用于各种生物，用于各种研究。为了控制有害生物，已经采用了类似CRISPR/CAS9的系统采用了多种方法，从而使害虫易于各种杀虫剂，从而损害了害虫的生殖效果，从而阻碍了害虫的变质，并且还有许多其他的好处。本文回顾了CRISPR/CAS9的效率，并为基于CRISPR/CAS9的综合害虫管理提出了潜在的研究思想。CRISPR/CAS9技术已成功应用于几种害虫物种。但是，没有可用的评论可以彻底概述该技术在昆虫基因组编辑中的应用中用于害虫控制。此外，作者强调了CRISPR/CAS9研究的进步，并讨论了其未来的害虫管理可能性。
用于基因组编辑的 Cas9 核糖核蛋白的制备
通过递送预组装的 Cas9 核糖核蛋白 (Cas9 RNP) 进行基因组编辑是一种越来越流行的方法，适用于难以通过传统质粒和病毒方法进行遗传操作的细胞类型。Cas9 RNP 编辑稳健、精确、能够多路复用且不含遗传物质。它在细胞中的短暂存在限制了残留的编辑活性。该方案描述了通过异源表达和从大肠杆菌纯化来制备重组化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 蛋白，以及通过体外转录和 PAGE 纯化合成 CRISPR 向导 RNA。SpCas9 是第一个发现的 CRISPR Cas9（Jinek 等人，2012 年），也是基因组编辑应用中最典型的 Cas 酶之一。使用这种 Cas9 RNP 配方，我们已证明通过电穿孔在原代人类 T 细胞和自然杀伤 (NK) 细胞中以及通过聚乙二醇介导的转化在真菌和植物中实现了高效的基因组编辑。我们的 Cas9 RNP 制备协议是一致且简单的，可用于其他细胞类型和生物体的基因组编辑。
crispr cas9
NHEJ修复途径是最活跃的修复机制，经常导致核苷酸（Indels）的小插入或缺失到DSB位置。由NHEJ介导的DSB修复的随机性具有重要的实际意义，因为表达Cas9和ARNG的细胞群将导致广泛的突变。在大多数情况下，NHEJ在靶DNA中产生了小散析，从而导致氨基酸框架中的缺失，插入或突变导致靶向基因的开放式读数（ORF）中的过早终止密码子。理想的最终结果是突变，靶向基因的功能损失。但是，必须通过实验验证给定突变细胞的“敲除”表型的强度。
对照 CRISPR/Cas9 质粒：sc-418922
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Cas9 融合可实现精确的体内编辑
Cas9 以高特异性靶向基因组位点。然而，当用于敲入时，Cas9 通常会导致非预期的靶向敲除，而不是预期的编辑。这种不精确性是无法进行克隆选择的直接体内编辑的障碍。在这里，我们展示了一种高通量工作流程，以比率方式评估编辑结果的靶向效率和精度。使用这种工作流程，我们筛选了供体 DNA 和 Cas9 变体的组合，以及与 DNA 修复蛋白的融合。这产生了新的高性能双链断裂修复编辑剂和组合优化，敲入精度提高了几个数量级。Cas9-RC 是一种与 eRad18 和 CtIP 融合的新型 Cas9，在发育中的小鼠大脑中，体外和体内的敲入性能提高了 3 倍以上。继续使用这种效率和精度的比率框架对现有和新型编辑剂进行比较评估，将进一步促进直接体内敲入和未来基因疗法的发展。
CRISPR/CAS9在生殖生物学中的应用
抽象的基因组编辑正在揭示其在科学发展和理解的广泛领域的好处。基因组编辑从ZFN和CRISPRS升级到CRISPR的进步定义了其广泛的应用。繁殖是所有生物体维护其几代人的基本过程。crispr/cas9，一种新的多功能基因组编辑工具最近被驯服，以纠正几种疾病，导致基因突变，并扩散其手臂以改善生殖健康。它不仅编辑有害的遗传突变，而且还用于通过引入自私的遗传元素来控制寄生虫疾病（例如疟疾）的传播，这些遗传元素通过生殖传播到世代和人群中。这些应用使我们回顾了CRISPRS在再生生物学中的最新发展。
CRISPR/Cas9 基因组编辑技术
在过去的 5 年里，成簇的规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9 (CRISPR/Cas9) 技术已成为分子生物学研究的焦点。作为基因组编辑领域的变革者，CRISPR/Cas9 技术彻底改变了动物研究，包括医学研究和人类基因治疗以及植物科学研究，尤其是作物改良。CRISPR/Cas9 最常见的应用之一是生成基因敲除突变体。最近，开发了几种利用 CRISPR/Cas9 的多重基因组编辑方法，并将其应用于植物研究的各个方面。在这里，我们总结了这些方法与植物的关系，特别是在理解植物细胞壁的生物合成和功能方面。植物细胞壁是一种富含多糖的细胞结构，对植物细胞的形成、生长和发育至关重要。人类严重依赖植物细胞壁的副产品，如住所、食物、衣服和燃料。参与植物细胞壁组装的基因通常高度冗余。为了识别这些冗余基因，需要生成高阶敲除突变体，这通常是通过遗传杂交来实现的。与遗传杂交相比，CRISPR/Cas9 多基因靶向可以大大缩短高阶突变体的生成和筛选过程，这对于表征需要较长生长时间的植物物种中的细胞壁相关基因尤其有用。此外，当无效 T-DNA 突变体不可用或存在遗传连锁时，CRISPR/Cas9 可以敲除基因。由于这些优势，CRISPR/Cas9 正在成为在植物细胞壁研究中进行功能研究的理想且不可或缺的工具。在这篇综述中，我们提供了关于如何设计 CRISPR/Cas9 以实现植物中高效基因编辑和多基因靶向的观点。我们还讨论了基于病毒的 CRISPR/Cas9 系统的最新发展以及 CRISPR/Cas9 在基因敲入中的应用。最后，我们总结了目前利用 CRISPR/Cas9 表征植物细胞壁相关基因的进展。