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CRISPR/Cas9在CAR-T中的应用与探索...
癌症免疫疗法是继手术、化疗和放疗之后的第四大主流治疗方法。过继性T细胞免疫疗法，特别是嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，彻底改变了癌症治疗，尤其是在FDA批准Kymriah和Yescarta（用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤的CD19靶向CAR-T细胞）[1-3]之后。CAR是合成受体，通常含有抗体衍生的靶标结合胞外结构域、铰链区、跨膜结构域和能够激活T细胞的胞内信号传导部分[4,5]。用CAR编程的T细胞可以特异性识别和杀死表达抗原的细胞，而不受主要组织相容性复合体（MHC）的限制。临床数据表明，CAR-T 细胞疗法可使多种血液系统和实体肿瘤患者获得持久的完全缓解 (CR)，尤其是复发/难治性急性淋巴细胞白血病 (ALL) 和多发性骨髓瘤，缓解率高达 80-100% [ 6 - 8 ]。尽管 CAR-T 细胞疗法疗效显著，
CAS9的组织特异性表达对整体没有影响...
目标：CRISPR/CAS9技术彻底改变了基因编辑，并快速跟踪了我们为研究和治疗应用的利益操纵感兴趣的基因的能力。虽然许多进步已经并且继续在该地区取得了成功，但迄今为止，最受使用的技术可能是敲除细胞，组织和动物的产生。这项技术的优点是许多折叠，但是关于外蛋白（例如Cas9）对哺乳动物细胞功能的长期表达的影响仍然存在一些问题。几项研究提出，CAS9的慢性过表达（无论是否伴随其伴随的指南RNA）可能会对细胞功能和健康产生有害影响。在体内应用这项技术时，这是特别关注的问题，其中Cas9在感兴趣的组织中的慢性表达可能会促进类似疾病的表型，从而使对感兴趣基因效应的研究混淆。尽管这些担忧仍然有效，但尚无对我们知识的研究直接证明这一点。方法：在这项研究中，我们使用了Lox-Stop-lox（LSL）SPCAS9 ROSA26转基因（TG）小鼠系列来生成四种组织特异性CAS9-TG模型，这些模型在心脏，肝脏，骨骼肌或脂肪组织中表达Cas9。，我们对这些小鼠进行了全面的表型，直到20周龄，随后对其器官进行了分子分析。2021作者。由Elsevier GmbH出版。这是CC BY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）下的开放访问文章。结果：我们证明CAS9在这些组织中的表达对动物的全身健康没有不利影响，也没有诱导组织对全身能量代谢，肝脏健康，炎症，纤维化，纤维化，心脏功能或肌肉质量的任何特异性影响。结论：我们的数据表明，这些模型适合使用LSL-CAS9-TG模型研究基因缺失的组织特异性效应，并且使用这些模型观察到的表型可以用来构成基因，并且不能被基因特异性解释，而不是由Cas9 cas9的慢性过表达的混淆。
CAS9生成条件小鼠等位基因的方法
1。我们对Yang等人发表的MECP2基因座的结果。已通过Jaenisch（8 - 10％正确的等位基因），Yang（8％正确的等位基因）和Hatada的组（2 - 6％正确等位基因）[3]的独立实验复制。此外，多个同行评审的出版物[3-7]成功使用了此方法来创建条件敲除（CKO）小鼠（在11个基因座中有9个成功，效率为2.5％至18％）。我们注意到，CRISPR/ CAS9生成CKO小鼠的效率可能会有所不同，这可能是由于平台特征或实验条件的不同。2。Gurumurthy等人使用的条件。[1]与我们论文中使用的条件不符。Gurumurthy等人使用的CRISPR试剂的浓度。 '在MECP2基因座上的研究[1]（Cas9 mRNA的10 ng/μL，SGRNA的10 ng/μL，寡核素的10 ng/μL）比Yang等人所用的 sgrNA的RNA和10 ng/μL）。 ' s实验（CAS9 100 ng/μL，SGRNA 50 ng/μL和100 ng/μL的实验）[2]和Yang等。 ' s先前[8]和以下出版物[9-12]。 众所周知，CRISPR试剂的浓度与基因组编辑效率密切相关。 3。 我们在原始论文中使用了压电驱动的合子注入方法，该方法允许以更高的浓度注入CRISPR组件。 Gurumurthy等人使用的该方法和前核注射方法之间的差异。 也可能有助于成功的利率差异。sgrNA的RNA和10 ng/μL）。 's实验（CAS9 100 ng/μL，SGRNA 50 ng/μL和100 ng/μL的实验）[2]和Yang等。 's先前[8]和以下出版物[9-12]。众所周知，CRISPR试剂的浓度与基因组编辑效率密切相关。3。我们在原始论文中使用了压电驱动的合子注入方法，该方法允许以更高的浓度注入CRISPR组件。Gurumurthy等人使用的该方法和前核注射方法之间的差异。也可能有助于成功的利率差异。
应用说明 | CTS HiFi Cas9 蛋白
图 1. CTS HiFi Cas9 蛋白 (CTS HF Cas9) 显著降低了原代 T 细胞中脱靶效应的发生率。将三种 Cas9 蛋白与三种 Invitrogen ™ TrueGuide ™ 合成 sgRNA 混合，形成九种复合物（RNP：50 pmol sgRNA、38 pmol Cas9、50 pmol dsTag，用于 Invitrogen ™ Neon ™ 转染系统中的 1.5 x 10⁶ T 细胞（100 µL）*）。使用 Neon 转染系统将每个 RNP 复合物递送到原代 T 细胞中。从 NGS TEG-seq 检测（点图）中获得每个 gRNA 的在靶和脱靶效应读数。每个脱靶/在靶比（蓝点）是根据单个脱靶的每百万读数 (RPM) 除以相应在靶的 RPM 计算得出的。红点代表相应的在靶，并标准化为 100%。 x 轴是任意的。CTS WT Cas9 是 CTS TrueCut Cas9 蛋白。
Cas9 用于增强基因组编辑以治疗复发
CRISPR-Cas9 技术有可能彻底改变包括雷特综合征在内的各种疾病的治疗方法，因为它能够纠正人类患者细胞中的基因或突变。然而，在其广泛应用于临床之前，需要解决几个挑战。这些挑战包括向靶细胞的低传递效率、基因组编辑过程的实际效率以及 CRISPR-Cas 系统运行的精确度。在此，该研究提出了一个磁性纳米粒子辅助基因组编辑 (MAGE) 平台，它显著提高了 CRISPR-Cas9 技术的转染效率、生物相容性和基因组编辑准确性。为了证明所开发技术的可行性，MAGE 被用于纠正雷特综合征患者诱导多能干细胞来源的神经祖细胞 (iPSC-NPC) 中突变的 MeCP2 基因。 MAGE 结合磁转染和磁激活细胞分选，实现了更高的多质粒递送 (99.3%) 和修复效率 (42.95%)，并且孵育时间明显短于传统转染剂，且不受质粒大小限制。修复后的 iPSC-NPC 在分化为神经元时表现出与野生型神经元相似的特征，进一步验证了 MAGE 及其未来临床应用的潜力。简而言之，开发的纳米生物组合 CRISPR-Cas9 技术为各种临床应用提供了潜力，特别是在针对不同遗传疾病的干细胞疗法中。
Temple University CRIS/CAS9生物安全指南
病毒输送，CAS9和GRNA是否会在单个转移载体/质粒或单独的转移载体/质粒上一起传递（因为它可以赋予更大的安全性）？使用相同病毒载体交付Cas9和GRNA的情况，如果有可能使一个或多个人类肿瘤抑制基因失活的话，可能会给实验室工人带来额外的风险。请考虑因这种风险而意外暴露的任何潜在风险，并证明您的实验设计是合理的。
CRISPR/Cas9 介导的 EZH2 敲除抑制了……
摘要：三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性极强的乳腺癌亚型，具有肿瘤内异质性的特点，与其他类型的乳腺癌相比，TNBC更易发生侵袭和转移。本研究旨在探讨腺病毒介导的成簇调控间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统是否能够有效靶向TNBC细胞中的zeste增强子同源物2（EZH2），为CRISPR/Cas9系统用于乳腺癌的基因治疗奠定实验基础。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑工具在MDA-MB-231细胞中敲除EZH2，建立EZH2敲除（KO）组（EZH2-KO组），另设GFP敲除组（对照组）和空白组（Blank组）。通过T7 内切酶I（T7EI）酶切、mRNA检测及Western印迹实验验证载体构建及EZH2-KO成功。通过MTT、划痕实验、Transwell及体内肿瘤生物学实验检测基因编辑后MDA‑MB‑231细胞增殖及迁移能力的变化。mRNA及蛋白检测结果显示，EZH2‑KO组EZH2的mRNA及蛋白表达均明显下调。EZH2 mRNA及蛋白表达的差异在EZH2‑KO组中有所体现。
重组 CRISPR Cas9 GMP 级高编辑...
MaxNuclease是来源于Serratia Marcescens的广谱核酸酶，可降解双链、单链、渐进和线性RNA和DNA等形式的核酸，将它们消化为3-5个碱基长度的5'-单磷酸寡核苷酸。本品利用大肠杆菌大规模发酵表达封闭，生产过程完全按照GMP生产原料的可后续标准进行，保证生产原料的可后续标准进行，是病毒疫苗类、病毒载体行业中重新核酸的不二选择！ 目前，该产品已通过美国FDA DMF备案，DMF编号为036799。
CRISPR/Cas9 基因组编辑用于组织特异性体内...
成簇随机间隔短回文重复序列 (CRISPR) 及其相关的核酸内切酶蛋白 Cas9 已被发现是细菌和古菌中的免疫系统；尽管如此，它们现在已被用作主流生物技术/分子剪刀，可以通过插入/删除、表观基因组编辑、信使 RNA 编辑、CRISPR 干扰等方式调节大量遗传和非遗传疾病。许多经食品和药物管理局批准和正在进行的 CRISPR 临床试验采用体外策略，其中基因编辑在体外进行，然后再植入患者体内。然而，CRISPR 成分的体内递送仍处于临床前监测之下。本综述总结了使用 CRISPR/Cas9 进行基因编辑的非病毒纳米递送策略及其最新进展、战略观点、挑战以及使用纳米材料进行组织特异性体内递送 CRISPR/Cas9 成分的未来方面。