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沉默基因可以降低胆固醇
在 Hepa 1-6 Pcsk9 tdTomato 细胞中进行的体外筛选表明，基于 ZFP 的 ETR 是 Pcsk9 表观沉默的最有效平台。a，左上角，用于比较 Hepa 1-6 Pcsk9 tdTomato 细胞系中不同 ETR 平台效率的实验程序图。右上角，Hepa 1-6 Pcsk9 tdTomato 细胞系的示意图，其中 TAV2A- tdTomato 盒式磁带以框架内的方式靶向 Pcsk9 的最后一个外显子。右下角，不同 ETR 平台的示意图，显示它们与 Pcsk9 启动子区域的 CGI 的相对结合。图片来源：Nature (2024)。DOI: 10.1038/s41586-024-07087-8
AAV 载体中新型组合 microRNA 结合位点协同减少抗原呈递和转基因免疫，实现高效、稳定的转导
重组腺相关病毒 (rAAV) 平台有望用于体内基因治疗，但抗原呈递细胞 (APC) 的不良转导会削弱其应用前景，而抗原呈递细胞又会引发宿主对 rAAV 表达的转基因产物的免疫。鉴于最近接受高剂量全身 AAV 载体治疗的患者出现的不良事件，推测这些不良事件与宿主的免疫反应有关，开发抑制先天性和适应性免疫的策略势在必行。使用 miRNA 结合位点 (miR-BS) 来赋予内源性 miRNA 介导的调控，使转基因表达脱离 APC，有望降低转基因免疫力。研究表明，将 miR-142BSs 设计到 rAAV1 载体中能够抑制树突状细胞 (DC) 中的共刺激信号、减弱细胞毒性 T 细胞反应并减弱小鼠转导肌细胞的清除，从而允许在肌纤维中持续转基因表达，同时几乎不产生抗转基因 IgG。在本研究中，我们针对 26 种在 APC 中大量表达但在骨骼肌中不表达的 miRNA 筛选了单个和组合 miR-BS 设计。高免疫原性卵清蛋白 (OVA) 转基因被用作外来抗原的替代物。在成肌细胞、小鼠 DC 和巨噬细胞中进行的体外筛选表明，miR-142BS 和 miR-652-5pBS 的组合强烈抑制了 APC 中的转基因表达，但保持了成肌细胞和肌细胞的高表达。重要的是，携带这种新型 miR-142/652-5pBS 盒的 rAAV1 载体在小鼠肌肉注射后比以前的去靶向设计实现了更高的转基因水平。该盒强烈抑制细胞毒性 CTL 激活和
使用合成的同源供体构建体进行 CRISPR 介导的同源重组，为果蝇基因标记提供扩展工具包
摘要 之前，我们描述了大量果蝇菌株，每个菌株都携带一个人工外显子，其中包含一个基于 CRISPR 介导的同源重组插入目标基因内含子中的 T2AGAL4 盒。这些等位基因可用于多种应用，并且已被证明非常有用。最初，基于同源重组的供体构建体具有较长的同源臂（>500 bps），以促进大型构建体（>5 kb）的精确整合。最近，我们表明，供体构建体的体内线性化使得能够使用短同源臂（100-200 bps）将大型人工外显子插入内含子中。较短的同源臂使得商业合成同源供体成为可能，并最大限度地减少了供体构建体生成的克隆步骤。不幸的是，大约 58% 的果蝇基因缺乏适合所有注释异构体中人工外显子的编码内含子整合。在这里，我们报告了新构建体的开发，这些构建体允许用 KozakGAL4 盒替换缺乏合适内含子的基因的编码区，从而产生与目标基因类似地表达 GAL4 的敲除/敲入等位基因。我们还开发了定制载体骨架，以进一步促进和改善转基因。在包含目标基因 sgRNA 的定制质粒骨架中合成同源供体构建体，无需注射单独的 sgRNA 质粒，并显著提高了转基因效率。这些升级将使几乎所有果蝇基因都能靶向，无论外显子-内含子结构如何，成功率为 70-80%。
用于人类基因组的强大且多功能的阵列文库...
图 1. APPEAL 克隆。A、从载体 pYJA5 中去除氨苄青霉素抗性基因 (AmpR)。sgRNA1-4 和甲氧苄啶抗性基因 (TmpR) 与三个不同的 PCR 扩增子融合。所有元件均经过 Gibson 组装以形成 4sgRNA-pYJA5 质粒，并用甲氧苄啶筛选转化子。描绘了 4sgRNA-pYJA5 全质粒和 4sgRNA 盒的详细结构。LTR，长末端重复；Ψ，包装信号序列；PB，piggyBac 转座子元件；PuroR，嘌呤霉素抗性元件；hU6、mU6、hH1 和 h7SK 是普遍表达的 RNA 聚合酶 III 启动子；sg，sgRNA。 B、转化大肠杆菌并进行甲氧苄啶筛选后，代表性 pYJA5 限制性片段、3 片段 PCR 和 APPEAL 克隆产物的单菌落 PCR。Bbs I 消化 pYJA5 产生约 1 千碱基 (kb) 的 AmpR 元件条带和约 7.6 kb 的线性化载体条带（左）。使用相应的 sgRNA 引物进行 PCR 后，三个扩增子在琼脂糖凝胶上分别显示预期的 761、360 和 422 bp 大小（中）。使用转化细菌平板中 APPEAL 克隆产物 4sgRNA 盒两侧的引物进行单菌落 PCR 始终产生预期大小（2.2 kb，右）。 C ，8 个具有不同 4sgRNA 序列的独立 APPEAL 实验中正确、重组和突变 4sgRNA 质粒的百分比（每个实验测试 ≥22 个菌落）。D ，四个 APPEAL 实验中正确、重组和突变 4sgRNA 质粒的百分比。每个点代表一个由八个菌落组成的独立生物复制品（n=24；平均值 ± SEM）。E ，高通量格式的 APPEAL 克隆时间线（h：小时；d：天）。
Cre/lox 调节条件性救援和失活......
摘要 在空间和时间上调节基因活性的能力对于研究发育过程中以及胚胎后过程和疾病模型中的细胞类型特异性基因功能至关重要。Cre/lox 系统已广泛用于对斑马鱼的基因功能进行细胞和组织特异性条件分析。然而，缺乏简单有效的分离稳定的 Cre/lox 调控斑马鱼等位基因的方法。在这里，我们应用了我们的 GeneWeld CRISPR-Cas9 靶向整合策略来生成可提供强大条件失活和拯救的 floxed 等位基因。通用靶向载体 UFlip 具有用于克隆位于 floxed 2A-mRFP 基因陷阱两侧的短同源臂的位点，被整合到 rbbp4 和 rb1 的内含子中。 rbbp4 off 和 rb1 off 整合等位基因导致强烈的 mRFP 表达、内源基因表达减少 99% 以上，并重现已知的 indel 功能丧失表型。Cre 的引入导致 floxed 盒的稳定倒位、mRFP 表达的丧失和表型挽救。rbbp4 on 和 rb1 on 整合等位基因与功能丧失突变相结合不会引起表型。Cre 的添加通过盒的稳定倒位、基因捕获和 mRFP 表达以及预期的突变表型导致条件性失活。神经祖细胞 Cre 驱动器用于条件性失活和表型拯救，以展示如何在特定细胞群中使用这种方法。这些结果共同验证了一种在斑马鱼中有效分离 Cre/lox 反应条件等位基因的简化方法。我们的策略为生成基因嵌合体提供了一种新的工具包，并代表了斑马鱼遗传学的重大进步。
评估 CRISPR/Cas9 基因组编辑对小麦病原菌 Parastagonspora nodorum 的功效
摘要背景：基因组编辑工具 CRISPR/Cas9 提供了一种产生靶向突变的有效方法，彻底改变了基因操作。该技术利用 Cas9 内切酶和向导 RNA (sgRNA)，它们相互作用形成 Cas9-sgRNA 复合物，通过引入双链 DNA 断裂来启动基因编辑。我们测试了 CRISPR/Cas9 方法作为促进小麦致病真菌 Parastagonospora nodorum 中各种反向遗传方法的有效性。结果：用 Cas9 蛋白和 sgRNA 转化 Parastagonospora nodorum 原生质体，以 Tox3 效应基因为靶点的预组装核糖核蛋白 (RNP) 复合物的形式转化。随后对 P. nodorum 转化子的筛选表明，筛选出的突变体 100% 被编辑。我们进一步测试了 RNP 复合物与含有 1 kb 同源侧翼 DNA 的 Tox3 -同源定向修复盒共转化时的功效。随后对所得转化子进行筛选，结果显示同源重组效率超过 70%。使用含有 50 bp 微同源侧翼的可选择标记的 Tox3 -同源定向修复盒进一步转化也实现了 25% 的同源重组效率。这些同源定向修复方法的成功表明 CRISPR/Cas9 适用于其他体内 DNA 操作方法，例如插入 DNA 和产生点突变。结论：这些数据突出了 CRISPR/Cas9 在加速 Parastagonospora nodorum 中无转基因基因敲除以及促进其他基因操作方法方面的巨大潜力。使用这些工具将大大减少评估疾病基因需求和进行功能研究以确定其作用所需的时间。关键词：CRISPR/Cas9、基因编辑、核糖核蛋白复合物、Parastagonospora nodorum
癌细胞耐药机制
摘要 在化疗药物治疗过程中，许多癌症对所用药物的治疗效果产生了抗药性。人们提出了各种与耐药性有关的机制。耐药性最重要的原因之一是膜转运蛋白大家族（ATP 结合盒 ABC）中 ATP 依赖性膜蛋白的高表达。在这个家族中，分子量为 170 KDa 的膜转运蛋白，即糖蛋白 P，在耐药性中起着重要作用。MRP（多药耐药相关蛋白）家族的其他膜蛋白也与耐药性有关。ABC 蛋白也在正常细胞中表达。上述蛋白质负责内源性底物的转移。这些蛋白质在癌细胞中的高表达是癌症治疗的最重要障碍。临床反应的范围是由治疗的药用品质以及癌细胞的内部和后天分子和物理特性以及外部环境因素引起的。后者可能由多种因素引起，例如DNA修复能力增强、药物代谢改变、药物靶标突变或改变、药物积累减少以及细胞死亡信号失活。癌症干细胞（CSC）表现出耐药性。因为转运蛋白过度表达三磷酸腺苷（ATP）结合盒。通过特定的调控基因，FOXM1（一种特定于细胞增殖的转录因子）控制G1/S和G2/M细胞周期阶段之间的转换。此外，它是一种导致癌细胞扩增和增殖的致癌基因。通过ABCC5（ATP结合盒亚家族成员5）的表达，FOXM1过度表达导致鼻咽癌对紫杉醇产生耐药性。
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发现，我们发现横向流量套件的总平均重量范围从每次测试13.7 g到84.6 g。套件中标准外壳的平均重量为每个套管4.1 g（范围：2.8-6.5）。包装在整个套件的34％至89％以上，被发现是重量变化的巨大来源。在标准套件中，塑料平均占总重量的36％，而纸张和纸板平均占52％。在具有更新的盒式设计的非标准套件中，观察到了相反的情况。
评估基于CRISPR的基因驱动的可能性污染了另一个物种
fi g u r e 2一系列推定的事件导致在另一个遥远相关的非目标物种中插入功能性基因驱动盒（如果没有杂交的情况下）。Div> dna以灰色为灰色和DNA，以温暖的颜色：粉红色：cas9基因，橙色：grna基因和棕色：相邻序列。是Draque方程的不同参数。在代表的情况下，一条线（长插入元素）和一个可转座元素（TE）用作同源指导修复的侧翼序列。请注意，也可以使用非目标主机中存在的其他序列
通过 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白和基于 URA3 的标记回收对炭疽菌进行有效的多基因敲除
图 1. CRISPR-Cas9 RNP 促进 C. higginsianum 中与供体 DNA 的同源重组。（a）CRISPR-Cas9 RNP 介导的 HDR 示意图。首先，将重组 Cas9 蛋白（橙色）和针对目的基因 (GOI) 的合成 gRNA（洋红色）在体外混合以形成 RNP。其次，用 RNP 和供体 DNA 转化 C. higginsianum 原生质体，其中供体 DNA 具有选择标记 NPTII，两侧是两个同源臂。最后，通过结合选择培养基和基于 PCR 的筛选来分离用选择盒替换 GOI 的菌株。（b）URA3 敲除的构建设计。供体 DNA 具有选择标记，即 NPTII 表达盒，两侧是 0.5 kb 的同源臂，以浅灰色框表示。箭头表示扩增 ura3 基因组中特异性存在的“片段 1”和“片段 2”的引物。（c）转化子数量和 URA3 敲除率。左图显示每板转化子数量，右图显示每板 URA3 敲除率（n =5）。“-gRNA”和“+gRNA”分别代表不含和含 gRNA 的结果。星号表示统计差异（p < 0.001，Welch t 检验）。通过 PCR 筛选评估 URA3 的敲除，如 (d) 所示。（d）ura3 突变体的 PCR 筛选。使用 (b) 中所示的引物组，在含有 500 µg/ml G418 的 MA 上使用每个菌落进行 PCR。显示了从 -gRNA 和 +gRNA 转化子中随机选择的七个菌落的结果。 C. higginsianum 肌动蛋白基因 (CH63R_04240) 的 238 bp 片段被指定为肌动蛋白。凝胶左侧的数字表示 DNA 大小标记 (bp) 的位置。