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AM2684 Ambion™RNase抑制剂（克隆）
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人类P2
寡脱氧核苷酸的杂交特性已经以多种技术为特征（1-4）。在适当条件下，寡核苷酸与DNA中的特定位点杂交（4，5）。此外，可以将完美的碱基配对的核苷酸双链体与包含单个不匹配的碱基对（4-6）的复式区分开。我们利用寡核苷酸的杂交特性在开发一种分离特定克隆的DNA序列的方法中（5）。我们的一般方法是化学合成寡核苷酸的混合物，这些寡核苷酸代表给定蛋白的一小部分氨基酸序列的所有可能的密码子组合。在该混合物中必须是与蛋白质该部分编码的DNA相结合的一个序列。这种互补的寡核苷酸将与来自蛋白质的编码区域的DNA形成完美的基础复式，而混合物中的其他寡核苷酸将形成不匹配的双链体。在严格的杂交结合下，只有完美匹配的双链体将形成，从而允许将寡核苷酸的混合物用作特定的杂交探针。混合序列寡核苷酸探针应允许分离出已知氨基酸序列的任何蛋白质的克隆DNA序列。我们已将这种方法应用于人A2-微球蛋白（AM）的克隆cDNA序列的分离。AM是一种从尿液中分离出来的小蛋白（分子量11,800）。随后，发现A3〜m与主要组织相容性基因座的细胞表面抗原相关（8、9）。A2M的确切功能尚不清楚，尽管最近的证据表明该分子可以稳定辅助蛋白的三级结构（10）。氨基酸序列已从包括人类在内的四个物种中定位为F2M（11）。我们已经使用氨基酸序列来设计探针，以分离到人类2M的克隆cDNA。
AIDoppelgänger困境：音乐行业的克隆声音
随着生成人工智能的兴起（AI）的兴起，已经涌入了“语音克隆” - 深度学习算法，这些算法会创造出与现实模仿人类声音的综合语音。名人，在特殊的音乐艺术家中，已经在Tiktok和Spotify等社交媒体平台上的AI语音克隆扩散。尽管音乐利用AI语音克隆积累了很多知名度，但这项技术可能对音乐家有害和高度侵略，他们的生计通常取决于他们独特的声音。虽然法律学者试图阐明可以保护一个人声音的各种权利，但个人在很大程度上受到了最小的保护，以防止AI语音克隆，几乎没有任何补救选择。一些法律学者提出了各种侵权行动，可以在此文本中采用。但是，诸如宣传权，诽谤和虚假光线之类的侵权行为最终落后。本说明认为，需要采用拼凑的方法来调节和应对AI语音克隆的危害，包括在州和联邦一级的行动，以及通过流媒体平台和音乐家本身在私营部门中的自我调节。这种方法包括所有受AI语音克隆影响的参与者的意见，应平衡促进创造力和持续发展AI的发展，同时也保护个人对他人的语音和相似性的利益。
有效扩增克隆插入片段和人类基因组 DNA 中的长靶标
摘要 我们利用聚合酶链式反应 (PCR) 从人类基因组 DNA 中扩增出长达 22 kb 的 3-珠蛋白基因簇，并从噬菌体 A DNA 中扩增出长达 42 kb 的 3-珠蛋白基因簇。我们还直接从重组 A 斑块中扩增出 91 个 9-23 kb 的人类基因组插入片段。为此，我们增加了 pH 值，添加了甘油和二甲基亚砜，减少了变性时间，增加了延伸时间，并使用了具有 3'-至-5'-外切酶或“校对”活性的次级热稳定 DNA 聚合酶。我们的“长 PCR”方案通过使用较低水平的聚合酶和温度和盐条件进行特定引物退火，保持了基因组 DNA 中目标所需的特异性。扩增10-40 kb DNA序列的能力将为基因组图谱和测序带来PCR的速度和简便性，并促进分子遗传学研究。
甲状腺癌治疗中的药物重新定位
生物压力是稳定稻米生产的主要威胁之一。气候变化会影响时空和空间上的害虫爆发的转移。遗传改善了水稻中生物胁迫抗性的方法是一种具有成本效益和环境友好的控制疾病和害虫的方式。通过标记辅助选择（MAS）在本地精英品种中快速部署可用的基因/等位基因（MAS）对于稳定的高产量水稻生产至关重要。在这篇综述中，我们专注于合并所有可用的克隆基因/等位基因，以赋予对水稻病原体（病毒，细菌和真菌）和虫害的耐药性，相应的供体材料以及与识别基因相关的DNA标记。迄今为止，仅针对主要的生物胁迫克隆了48个基因（独立基因座）：棕色Planthopper的7个基因（BPH），爆炸的23个基因，13个用于细菌疫病的基因，病毒的五个基因。图形上将48个基因的物理位置映射在12个水稻染色体上，以便育种者可以轻松地发现所有生物抗性抗性基因和任何其他靶性状基因的靶基因的位置和距离。为克隆基因的有效使用，我们收集了与识别基因相关的所有公开可用的DNA标记（〜500个标记）。对于其他生物应力尚无可用的克隆基因，我们提供了简短的信息，例如供体种质，定量性状基因座（QTL）和相关论文。本综述中描述的所有信息都可以促进稳定的高产水稻生产大米中生物胁迫耐药性的快速遗传改善。
经过精确编辑的克隆小牛基因组没有显示出脱靶事件或从头诱变增加的证据
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2021 年 1 月 29 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.01.28.428703 doi：bioRxiv 预印本
完全从克隆的互补DNA中拯救第一个alphanucleorhabdovirus：一种有效的载体，用于MAI
fi g u r e 1从植物中的全长cDNA克隆中拯救感染性玉米镶嵌病毒（MMV）。（a）PJL-MMV-WT，PTF-N＆P和PJL-L-Lintron质粒的示意图。全长的MMV型质粒设计用于转录，以产生MMV抗原组RNA（AgRNA），并包含位于截短的CAMV Double 35S启动子（2×35s）和肝炎乙肝（RZ）rzl89 bjl89 bilary prinary prinary pharine pharione phinary phinary phinary phincy sequence之间的全长MMV cDNA。请注意，序列以抗原（mRNA）感显示。在PTF二进制质粒中的2×35s和35s终结序列之间插入了N和P的全长cDNA。L的全长cDNA与植物内含子ST-LS1插入2×35s和35S终结序列之间的植物内含子cDNA，在PJL89二元质粒中。（b）用含有PJL-MMV-GFP，PTF-N＆P和PJL-L-INTRON质粒的农杆菌菌株的农杆菌菌株的示意图，并说明了PJL-MMV-GFP质粒构建。全长PJL-MMV-GFP包含重复的N/P基因连接，将MMV抗原组cDNA的N和P基因之间的GFP基因两侧。le，领导者； TR，拖车； Ter，终结者； TEV，烟草蚀刻病毒； LB，左边界序列； RB，右边界序列。（c）通过烟草本尼亚娜（Nicotiana Benthamiana）的MMV救援程序的例证，并转移到玉米和Peregrinus Maidis Planthoppers。dpi，接种后天。图1C：使用biore nder.com
利用 CRISPR/Cas9 介导的靶向整合生成 Y 染色体中含有 EGFP 基因的转基因克隆水牛胚胎
性别控制技术在家畜生产中具有重要意义，尤其对于快速繁殖的水牛（bubalus bubalis）具有重要意义，本研究以水牛为研究模型。我们已证实整合到小鼠Y染色体上的荧光蛋白可用于小鼠植入前胚胎的性别鉴定。首先，我们优化了增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和mCherry外源基因在Neuro-2a细胞、小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎细胞（NIH3T3）、水牛胎儿成纤维细胞（BFF）中的靶向整合效率。结果表明，靶标两侧同源臂长度为800 bp比300 bp或300 bp/800 bp更有效。当细胞补充了 pifithrin-µ（一种抑制 p53 与线粒体结合的小分子）时，BFF 细胞中同源定向修复 (HDR) 介导的敲入也得到了显著改善。250 V 的三个脉冲在 BFF 细胞中产生最有效的电穿孔，并且发现 1.5 µ g/mL 嘌呤霉素是筛选的最佳浓度。此外，利用 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑结合体细胞核移植 (SCNT) 技术成功生成了 Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞和克隆水牛胚胎。在第 6-8 代时，Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞的生长率和细胞增殖率明显低于非转基因 BFF 细胞；甲基化相关基因 DNMT1 和 DNMT3a 的表达水平相似；然而，与非转基因细胞相比，Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞中乙酰化相关基因 HDAC1 、 HDAC2 和 HDAC3 的表达水平显著较高（p < 0.05）。Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 被用作 SCNT 的供体，结果表明 eGFP 报告基因适用于胚胎性别的可视化。克隆水牛胚胎的囊胚率相似；然而，与对照相比，转基因克隆胚胎的卵裂率明显较低。总之，我们优化了产生转基因 BFF 细胞的方案，并使用这些细胞作为供体成功产生了 Y-Chr-eGFP 转基因胚胎。
Bioxp®DNA扩增套件用户指南
图1。用户输入区分了BioXP系统上DNA扩增的工作流程。对于所有三个选项，可以使用限制酶来消化产物，以获取放大DNA的线性片段。套件的选择取决于所需的自动化程度。Acceptable inputs are sequence-confirmed plasmid templates that will be amplified on the BioXp system (left), DNA fragments and the appropriate cloning vectors which are subsequently cloned and amplified on the BioXp system (middle), and digital sequences to be synthesized, cloned into user-provided vectors, and amplified on the BioXp system.请注意，对于所有克隆应用，吉布森组装是克隆方法，序列必须具有与吉布森组装兼容的悬垂。