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使用 CRISPR 阵列分离器增强 Cas12a 多基因调控
图 1. crRNA 性能受上游间隔物的 GC 含量影响 (A) CRISPR-Cas12a 操纵子由 Cas 基因和一个 CRISPR 阵列组成。(B) 每个 crRNA 由一个重复序列和一个间隔物组成。预处理重复序列包含一个 ~16-18-nt 片段，此处称为 CRISPR 分隔符，该片段由 Cas12a 和一种未知酶切除。(C) 在哺乳动物细胞中表达 Cas12a 阵列时，之前已省略了分隔符。我们想了解分隔符是否有助于使 crRNA 免受间隔物中二级结构的负面影响。(D) 我们设计了由两个 crRNA 组成的 CRISPR 阵列，第一个具有非靶向无义间隔物，第二个靶向 GFP 启动子，该启动子在 HEK293T 细胞中基因组整合。(E) 实验设置；分析 GFP 荧光作为阵列性能的衡量标准。 (F) CRISPR 阵列可以显示出对无义间隔物的组成的超敏感性。在极端情况下，将最后一个核苷酸从 T 替换为 G 可能导致 GFP 激活几乎完全终止。(G) 51 个 CRISPR 阵列的文库，其中第一个 crRNA 包含一个具有不同 GC 含量的无义间隔物，第二个 crRNA 靶向 GFP。无义间隔物的 GC 含量与 GFP 荧光之间存在强烈的负相关性。每个点代表 51 个 CRISPR 阵列中的一个（三个重复）。根据阵列启用的 GFP 荧光水平将阵列分为三组。框表示在 I 和 J 中分析的两组。(HJ) 对于每个组，计算了滑动 5-nt 窗口的平均 GC 含量。性能最佳的阵列是无义间隔物在其 3' 端恰好具有低 GC 含量的阵列。一些阵列因其无义间隔物的 GC 含量 ( G ) 而显示出意外的高或低 GFP 活性。这些阵列在其无义间隔物的 3' 端含有低 ( I ) 或高 ( J ) GC 含量，这表明最后几个碱基的 GC 含量是阵列性能的重要预测因素。HJ 中的阴影区域表示标准误差。( K ) 了解无义 crRNA 中 3-nt 区域 GC 含量的预测能力 (方法)。( L ) 显示预测的二级结构 (-Δ(最小自由能)) 和 51 个无义间隔物的 GC 含量之间关系的图。
