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BMP7B和BMPR1BA脆皮斑马鱼
1 Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, Faculty of Medicine, University Freiburg, 79104 Freiburg, Germany 2 Faculty of Health, Security, Society, Furtwangen University, Furtwangen, Germany Corresponding author: Stephan.heermann@hs-furtwangen.de Abstract The visual system is highly specialized and its function is substantially depending on the proper development of眼睛。早期眼睛发育始于单个眼场的定义，该视野位于前神经板（ANP）中。该单一眼场连续分开，两个视线囊泡在侧面出现。然后将这些囊泡转化为光学杯，未来视网膜在其中有所区别。全脑脑（HPE）是一种频繁的发育前脑疾病，其中ANP结构域的分裂受到阻碍。hpe主要是遗传联系的，我们最近表明，BMP拮抗作用对于眼场和远程脑分裂至关重要。过多的BMP诱导导致视网膜祖细胞卡在畸形前脑内。在这项研究中，使用斑马鱼作为模型，我们在F0一代中使用急性CRISPR/ CAS9分析显示了BMP7B和BMPR1BA的必要性，以进行适当的前脑发育。在两个基因的清脆中，我们都发现了HPE表型，例如环境。对BMP7B酥脆的进一步分析表明，主要是眼场受到影响，而不是远程脑前体域。关键词：BMP7B，BMPR1BA，Holoprosencephaly，Cyclopia，BMP
斑马鱼的 Crispant 分析作为 1 的快速功能筛选工具
。CC-BY 4.0 国际许可证永久有效。它以预印本形式提供（未经同行评审认证），作者/资助者已授予 bioRxiv 许可，可以在该版本中显示预印本。版权持有者于 2024 年 11 月 7 日发布了此版本。；https://doi.org/10.1101/2024.06.27.601074 doi：bioRxiv 预印本
评估 CRISPR-Cas9 在生成中的效率......
a.bonillap@uniandes.edu.co 摘要 - 神经连接蛋白 (NL) 是跨突触细胞粘附蛋白，当它们与突触前神经连接蛋白相互作用时，参与形成突触。越来越多的证据表明它们与某些神经精神疾病有关，这使它们成为研究的相关蛋白质。神经连接蛋白-1 基因 (nlgn1) 是 NL 家族的一员，参与兴奋性突触，与压力相关疾病（重度抑郁症和创伤后应激障碍）的遗传基础有关。然而，它在压力调节中的具体作用尚未得到详细研究。斑马鱼 (Danio rerio) 已成为转化神经科学和行为研究的模型，可用于研究与焦虑、恐惧、睡眠、压力和记忆相关的行为，使其成为此类研究的理想模型。在这里，我们旨在使用 CRISPR-Cas9 系统生成 nlgn1 缺陷斑马鱼，并评估这种基因改造对幼虫行为的影响。为此，我们必须标准化 CRISPR 基因编辑系统。我们最初使用 CRISPR-cas9 生成 tyr -crispant 斑马鱼胚胎，因为这会产生可见的表型。我们用 tyr 验证了我们的 CRISPR 基因编辑系统，产生了具有不同程度嵌合性的 crispant 样表型，效率约为 76%。然后，注射了针对 nlgn1 基因的 sgRNA 的斑马鱼胚胎的存活率较低，在 11.9% 到 7% 之间，具体取决于所使用的 sgRNA。此外，许多胚胎在发育过程中出现畸形，并在 3dpf 时致命。在旷场测试期间，nlgn1 -crispant 和对照组之间的不动性平均值有显著差异。这些结果表明，神经连接蛋白-1 可能在发育过程中发挥关键作用或具有强烈的神经表型。
使用Snudda
肠神经系统（ENS）提供了胃肠道（GI）的内在神经，该神经（GI）具有数百万个神经元和多种神经元亚型和神经胶质细胞的内在神经。ENS调节基本的肠道功能，例如运动，营养摄取和免疫反应，但有关控制ENS神经元规范和分化的基因的基本信息仍然很大程度上未知。ENS神经元数量和组成的缺陷会导致肠道功能障碍，使GI症状具有使人衰弱的症状，并且与例如Hirschsprung病，炎症性肠道疾病，自闭症谱系障碍和神经退行性疾病，例如帕金森氏病。大多数ENS疾病的遗传基础仍然未知。最近的转录组分析已经确定了许多用于调节ENS神经发生的候选基因。然而，对这些候选基因的功能评估显着滞后，因为它们在ENS神经发生中的作用进行了实验性测试是耗时且昂贵的。在这里，我们在斑马鱼中开发了快速，可扩展的F 0 CRISPR基因组编辑筛选，以确定哪些候选基因控制ENS中的神经元发育。概念验证实验针对已知的ENS调节剂SOX10和RET表观稳定突变体具有高效率和精确度，表明我们的方法可靠地使用F 0指导RNA注射的幼虫来识别ENS神经发生（F 0 Crispants）。然后，我们评估10个转录因子基因在调节ENS神经发生和功能方面的作用。靶向2-3个候选基因的引导RNA的池将Cas9蛋白共同注入到一个单细胞阶段PHOX2BB中：GFP转基因斑马鱼胚胎，以直接评估ENS神经元数量的定性变化与6天旧F 0旧F 0 Crispants相比。然后对表现出降低的ENS神经元数的清晰池的靶基因进行单独测试，以鉴定负责任的基因。我们确定了五个转录因子，这些转录因子显示ENS神经元的降低，表明对肠祖细胞细胞分化为ENS神经元。添加了一个简单有效的测试以进一步评估肠道变化，我们发现两个转录因子基因的功能丧失减少了通过肠道标记的荧光标记食物的肠道转运。总而言之，我们的新颖，多步骤但直接的CRISPR筛选方法在斑马鱼中可以测试ENS发育和疾病基因功能的遗传基础，这些遗传基础将促进对转录组，全基因组关联或其他ENS-OMICS研究而产生的流形候选基因的高通量评估。这种体内清晰的屏幕将有助于更好地理解脊椎动物中的ENS神经元发展调节，以及在ENS疾病中出现的问题。