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整体神经网络的现状与发展前景
摘要：高通量遗传筛选有助于发现触发特定细胞功能和/或表型的关键基因或基因序列。功能丧失性遗传筛选主要通过RNA干扰（RNAi）、CRISPR敲除（CRISPRko）和CRISPR干扰（CRISPRi）技术实现。功能获得性遗传筛选主要依赖于cDNA文库的过表达和CRISPR激活（CRISPRa）。碱基编辑可以进行功能获得性和功能丧失性遗传筛选。本综述讨论了基于Cas9核酸酶的遗传筛选技术，包括Cas9介导的基因组敲除和基于dCas9的基因激活和干扰。我们将这些方法与以前基于RNAi和cDNA文库过表达的遗传筛选技术进行了比较，并提出了CRISPR筛选的未来前景和应用。
回顾使用 CRISPR 进行基因编辑的使用情况...
图 3. CRISPR-Cas 应用。 A）基因编辑。利用Cas9可以促进基因组中单个位点或两个位点的切割。在第一种情况（A1）中，切口的修复可以通过 NHEJ 进行，这可以通过随机插入或删除导致基因沉默，或者如果将修复模板引入细胞，则可以通过 HDR 进行修复，这将允许将新序列引入基因组以修改基因、引入点突变等。在第二种情况下（用两个 sgRNA 进行转化），可以发生两次 DNA 切割（A2），因此可以消除 DNA 序列，甚至可以进行易位。 B、C) dCas9 不具有核酸酶活性，也可以与阻遏物或激活物融合使用，以使用 CRISPRi (B) 减少或沉默基因，或使用 CRISPRa (C) 增加基因表达。 （图片由 BioRender.com 生成）
ACD15，ACD21和SLN调节MBD6对沉默基因和转座元素的积累和迁移率
DNA甲基化通过募集Arabi-Dopsis MBD5/6复合物的部分介导了转座元素和基因的沉默，其中包含甲基-CPG结合结构域（MBD）蛋白MBD5和MBD6，以及MBD6，以及J-Domain含有J-Domain含有蛋白质Silenzio（SLN）。在这里，我们表征了另外两个复杂成员：含有蛋白ACD15和ACD21的α-晶体结构域（ACD）。我们表明，它们对于基因上是必要的，桥接到复合物，并促进异染色质内MBD5/6复合物的高阶多聚化。这些复合物也是高度动态的，MBD5/6复合物的迁移率由SLN活性调节。使用DCAS9系统，我们证明将ACD束缚在异染色质外部的异位部位上可以将MBD5/6复合物的大量积累带入大型核体。这些结果表明，ACD15和ACD21是基因分解MBD5/6复合物的关键组成部分，并作用着驱动CG甲基化（MECG）位点的高阶，动态组件的形成。
BEVS 中 CRISPR–Cas9 工具转录抑制和基因破坏的比较
摘要：利用杆粒重组生成敲除病毒大大加速了杆状病毒基因在各种应用中的审查。然而，与传统的重组和 RNAi 方法相比，CRISPR-Cas9 系统是一种强大的工具，可简化序列特异性基因组编辑和有效的基因转录调控。本文比较了 CRISPR-Cas9 系统在 BEVS 中对基因破坏和转录抑制的有效性。开发了组成性表达 cas9 或 dcas9 基因的细胞系，并评估了递送 sgRNA 的重组杆状病毒对报告绿色荧光蛋白基因的破坏或抑制。最后，针对内源性 AcMNPV 基因进行破坏或下调，以影响基因表达和杆状病毒复制。这项研究提供了一个概念证明，即 CRISPR-Cas9 技术可能成为通过有针对性的基因破坏和转录抑制来有效审查杆状病毒基因的有效工具。
高效的Cas9介导的转录编程
Cas9 是一种 RNA 引导的核酸内切酶，通过相关引导 RNA (gRNA) 与其靶基因座之间的互补性将其引导至特定 DNA 序列 1,2 。Cas9 可以通过 gRNA 引导至几乎任何任意序列，只需要靠近靶标的短原型间隔区相邻基序 (PAM) 位点 3–5 。通过突变分析，已经生成了缺乏核酸内切酶活性但仍保留与 DNA 相互作用能力的 Cas9 变体 2,6,7 。这些核酸酶无效 (dCas9) 变体随后被用效应结构域（例如转录激活结构域 (AD)）功能化，使 Cas9 能够用作转录水平细胞编程的工具 6,8–10 。在天然染色体环境下对特定靶标进行强有力的表达诱导编程的能力将为无数应用提供变革工具，包括开发治疗干预、基因筛选、激活内源性和合成基因回路、以及诱导细胞分化 11-13 。
使用患者特定...
功能性遗传筛选是一种重要方法，已被广泛用于探索遗传元素的生物学过程和功能注释。crispr/cas（群集定期间隔短的短质体重复序列/CRISPR相关蛋白）是遗传学家工具箱中的最新工具，使研究人员能够以前所未有的轻松，准确性和高吞吐量编辑基因组。最近，CRISPR干扰（CRISPRI）是作为一种新兴技术开发的，该技术利用了催化无效的Cas9（DCAS9）和单个指导RNA（SGRNA）来抑制序列特异性基因。在这篇综述中，我们总结了CRISPRI系统的特征，例如可编程，高度效率和特定的特征。此外，我们证明了其在功能遗传筛查中的应用，并强调了其剖析发病机理的潜在机制的潜力。CRISPRI系统的最新发展将为细菌中功能上重要的基因发现提供高通量，实用和有效的工具。
通过 CRISPR/ 解读植物染色质调控...
摘要：基于 CRISPR 的表观基因组编辑使用 dCas9 作为平台，在选定的位点招募转录或染色质调节因子。尽管最近取得了进展，但这些方法在体内研究染色质功能方面的全部潜力仍然难以充分发挥。在这篇综述中，我们讨论了植物和动物的最新进展如何为研究染色质调节因子的功能提供了新途径，并解决了通常相互关联的相关调节的复杂性。虽然已经开发出有效的转录工程方法，并且可以用作改变位点染色质状态的工具，但在植物中直接操纵染色质调节因子的例子仍然很少。这些报告还揭示了表观基因组工程方法的缺陷和局限性，但它们仍然具有参考价值，因为它们通常与位点和上下文相关的特征有关，包括 DNA 可及性、初始染色质和转录状态或细胞动力学。重点介绍了不同生物体为克服甚至利用这些局限性而实施的策略，这将进一步提高我们建立染色质动力学对基因组调控的因果关系和层次结构的能力。
Cas-CLOVER™：一种高保真基因组编辑系统...
与使用单个向导 RNA (gRNA) 进行序列特异性引导 CRISPR/Cas9 结合和切割相反，Cas-CLOVER™ 系统使用双 gRNA 引导核酸酶，其中酶的每个半位点亚基都含有催化无活性的 Cas9 (dCas9) 和 IIS 型限制性内切酶 Clo51 的融合蛋白。与广泛用于 TALEN 和锌指核酸酶 (ZFN) 的 FokI 一样，Clo51 活性取决于二聚体的形成，因此 DNA 切割严格依赖于特定距离内两个不同的 gRNA 引导内切酶同时靶向结合。虽然当两个半位点 gRNA 共同递送至细胞时观察到酶的高切割效率，但当单独递送任一半位点 gRNA 时，在原代人类 T 细胞中未观察到靶向破坏。此外，直接比较T细胞中的野生型（WT）CRISPR/Cas9和Cas-CLOVER™表明，在同一基因位点，两种系统都能高效编辑基因组。
荣誉和硕士研究项目2025
癌症是澳大利亚死亡的主要原因之一。数十年来，癌症的起源归因于基因突变，缺失和拷贝数放大。最近的进步照亮了异常表观遗传景观，这不仅有助于促进癌症的发展和进展。表观遗传标记是DNA或相关蛋白质中可遗传的共价修饰。表观遗传修饰提供了细胞“知道”和“记住”哪些遗传信息以及要忽略哪些遗传信息的机制。表观遗传修饰包括DNA缠绕的DNA甲基化和修饰。与遗传突变不同，表观遗传修饰是可逆的，这可用于恢复癌症中基因表达的正常状态。我们的实验室开发了新型的表观遗传组靶向疗法，以扭转在癌症中经常观察到的异常表观遗传修饰。在此提案中，我们旨在使用CRISPR/DCAS9系统扭转关键癌症驱动因素的表观遗传修饰。我们提出了开发小说和更有选择性的技术，能够稳定地抑制引起癌症扩散的基因。
利用 dCRISPR/Cas9 融合蛋白实现不依赖 DNA 甲基化的长期表观遗传沉默
可编程的 CRISPR/Cas9 DNA 核酸酶是一种多功能的基因组编辑工具，但它需要宿主细胞 DNA 修复机制来改变基因组序列。这一事实导致切割位点的基因组发生不可预测的变化。因此，人们迫切需要能够改变基因组而不会导致 DNA 双链断裂的基因组编辑工具。在这里，我们表明，启动子相关短向导 (sg) RNA 与融合到 Krüppel 相关框域 (KRABd) 的死 Cas9 (dCas9) 以及甲基 CpG 结合蛋白 2 (MeCP2) 的转录抑制域的表达可导致小鼠胚胎干细胞和人类胚胎肾 (HEK) 293 细胞中的持续基因沉默。令人惊讶的是，这种效果在 DNA（胞嘧啶-5）-甲基转移酶 3A 和 3B（Dnmt3A 2 / 2 、Dnmt3b 2 / 2 ）耗尽的细胞中是可以实现的，甚至会增强。我们的结果表明，dCas9-KRABd-MeCP2 融合可用于长期表观遗传基因沉默，可用于细胞生物学，并可能用于治疗环境。