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利用 dCas9-VPR 进行遗传性失明的基因治疗——...
催化失活的 dCas9 与转录激活因子 (dCas9-VPR) 融合能够激活沉默基因。许多疾病基因都有对应基因，它们具有相似的功能，但在不同的细胞类型中表达。弥补缺陷基因缺失功能的一个有吸引力的选择是通过 dCas9-VPR 转录激活其功能等效的对应基因。这种方法的主要挑战包括 dCas9-VPR 的递送、激活效率、靶基因的长期表达以及体内的不良反应。使用表达分裂 dCas9-VPR 的双腺相关病毒载体，我们展示了在缺乏视紫红质的视网膜色素变性小鼠模型中有效转录激活和长期表达视锥细胞特异性 M-视蛋白 (Opn1mw)。治疗一年后，这种方法改善了视网膜功能，减轻了视网膜变性，没有明显的不良反应。我们的研究表明，dCas9-VPR 介导的功能等同基因的转录激活对于治疗遗传疾病具有巨大潜力。
GB4.0平台，CRISPR/CAS ...
CRISPR/CAS能够同时瞄准多个基因座（多重）的能力是改变植物育种的游戏规则。多路复用不仅会加速性格金字塔，而且还可以揭示功能冗余所隐藏的特征。此外，多路复用增强了基于DCAS的可编程基因表达，并实现了类似级联的基因调节。然而，包含串联阵列导向RNA（GRNA）的多重构建体的设计和组装需要无疤的克隆，并且由于存在重复序列而仍然很麻烦，从而阻碍了更广泛的使用。在这里，我们介绍了软件辅助克隆平台Goldenbraid（GB）的全面扩展，其中除了其多基因克隆软件之外，我们将新的工具集成了新的工具，用于基于IIS的易于且六个串联阵容的GRNA，使用Cas9和cas12a，使用GRNA-trees-trees-trees-crrna-crrrna-crrrna和crrrnna crrrnna crrrnna crrrnna crrrna carrna-crrrna crrrna cas12a。作为新工具的应力测试，我们组装并用于农杆菌介导的稳定转化A 17 cas9-grnas构造，靶向烟草中的Squamosa-promoter结合蛋白样（SPL）基因家族的子集。14个选定的基因是miR156的靶标，因此在少年到成年和营养至生殖相变中可能起重要作用。使用17个grnas构建体，我们生成了一组无Cas9的SPL编辑的T 1植物，该植物携带了多达9个双重突变，并显示出叶少年和更多的分支。GB4.0 Genome Edition纳入了新的基于Web的工具和随附的DNA零件集合，为植物基因组工程提供了多合一的开放平台。使用荧光素酶lyanum lycopersicum mtb促进剂或Agrobacterium tumefaciens Nopaline benthase prospermers inice inice inice Amamaine inice Amamaine in NiceAtient在NICAPASE中，NICAPASE PROSSITER in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICASIEN中，NICAIN中的使用单个和多重GRNA的GB组装DCAS9和基于DCAS12A的CRISPR/CAS激活剂和阻遏物使用单一和多路复用GRNA的功能。使用单个和多重GRNA的GB组装DCAS9和基于DCAS12A的CRISPR/CAS激活剂和阻遏物使用单一和多路复用GRNA的功能。
核小体和染色质对 CRISPR-Cas12a DNA 靶向的抑制
基因组工程核酸酶必须接触染色质化的 DNA。在这里，我们研究了 AsCas12a 如何切割人类核小体和相浓缩核小体阵列内的 DNA。使用定量动力学方法，我们表明动态核小体解开调节靶标对 Cas12a 的可及性，并决定核小体抑制结合的两个步骤（PAM 识别和 R 环形成）的程度。通过降低 DNA 可弯曲性、添加组蛋白修饰或引入靶标近端 dCas9 来放松核小体内的 DNA 包裹，可将 DNA 切割率提高 10 倍以上。出乎意料的是，Cas12a 很容易切割染色质状、相分离的核小体阵列内的核小体间接头 DNA。由于相邻的核小体和染色质压缩，DNA 靶向仅减少了约 5 倍。这项研究解释了核小体中的靶向切割发生频率低于细胞中核小体耗尽的基因组区域内的脱靶切割的观察结果。我们得出结论，核小体解开调节 CRISPR-Cas 核酸酶的可及性，并提出增加核小体呼吸动力学将改善真核细胞中的 DNA 靶向性。
直接重新编程对诱导神经元的ins和uns
了解细胞类型的特定转录因子已促进了细胞重编程方法的进展，例如将体细胞直接重编程为诱导的神经元（IN）。直接重编程的方法需要神经元允许通过神经元特异性microRNAS确定基因激活，关键神经元信号通路的化学调节或通过病毒载体过表达的化学调节，并具有一些重编程策略，需要将这些方法组合来诱导神经元电池效果。这些方法已用于多种细胞类型，包括纤维细胞，肝细胞，外周血单核和T细胞。从皮肤活检和血液样本中创造的能力以及人工诱导的年龄和疾病相关的表型的最新进展正在加速迟到神经退行性疾病的疾病模型的发展。在这里，我们回顾了神经元转录组的激活如何改变供体细胞的表观遗传景观，以促进对神经元的重编程。我们还讨论了使用DNA结合结构域（例如CRISPR/DCAS9）通过激活内源性神经元细胞纳入确定基因来诱导神经元细胞命运的优势来诱导神经元细胞命运。
使用基于 CRISPR–Cas9 的方法对金黄色葡萄球菌进行基因组编辑
金黄色葡萄球菌中的染色体突变和靶基因缺失和失活通常使用等位基因交换方法产生。然而，近年来，已经开发出更快速的方法，通常使用基于 CRISPR - Cas9 的系统。在这里，我们描述了最近开发的用于金黄色葡萄球菌的基于 CRISPR - Cas9 的质粒系统，并讨论了它们在靶基因突变和失活中的用途。首先，我们描述如何将 CRISPR - Cas9 反选择策略与重组工程策略相结合以在金黄色葡萄球菌中产生基因缺失。然后我们引入死 Cas9 (dCas9) 和 Cas9 切口酶 (nCas9) 酶，并讨论如何使用与不同核苷脱氨酶融合的 nCas9 酶在靶基因中引入特定的碱基变化。然后，我们讨论如何通过引入提前终止密码子或突变起始密码子，使用 nCas9-脱氨酶融合酶来实现靶向基因失活。这些工具共同凸显了基于 CRISPR - Cas9 的方法在金黄色葡萄球菌基因组编辑中的强大功能和潜力。
应用能量
实验室进化是一种强大的方法，可以寻求对新表型的遗传适应性，但要么依赖于劳动力和选择的劳动密集型人类引导的迭代回合，要么基于自然发展的细胞种群，或者延长了适应状态。在这里，我们使用不断发展的嵌合供体GRNA持续从错误的t7 RNA聚合酶传递，并直接将作为RNA维修供体引入基因组ther cas9或DCAS9指南，并直接引入了基因组供体的GRNA，并在此处提供了CRISPR和RNA辅助在基因组基因座的体内进化（Craide）。我们通过进化辅助标志物基因的新功能变异，并通过在贝克酵母囊中对有毒氨基酸类似物的抵抗力，并以较高的延长的速度表明了较高的信息，从而提高了较高的速度，从而使自发性的速度更高，从而使无效的转移表明了viv viv viv viv viv viv viv viv， RNA供体模板不使用体外提供和预先编程的重对供体，为基因组环境。
通过靶向编辑 DNA 甲基化来下调 MGMT 表达可增强胶质母细胞瘤对替莫唑胺的敏感性
胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见、侵袭性最强的原发性肿瘤，预后较差。目前的金标准治疗方法是手术切除，然后结合放疗和化疗。主要化疗药物替莫唑胺 (TMZ) 的疗效取决于 O6-甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶 (MGMT) 的 DNA 甲基化状态，该酶已被确定为胶质母细胞瘤患者的预后生物标志物。临床研究表明，MGMT 启动子高甲基化的胶质母细胞瘤患者对 TMZ 治疗的反应更好，总体生存率显著提高。因此，在本研究中，我们使用 CRISPRoff 基因组编辑工具介导 MGMT 启动子区域内的靶向 DNA 甲基化。携带与甲基转移酶 (Dnmt3A/3L) 结构域融合的 CRISPR 失活 Cas9 (dCas9) 的系统通过靶向 DNA 甲基化下调 TMZ 耐药人类胶质母细胞瘤细胞系中的 MGMT 表达。 MGMT 表达水平的降低逆转了 TMZ 耐药性胶质母细胞瘤细胞系中的 TMZ 耐药性，导致 TMZ 诱导的剂量依赖性细胞死亡率。总之，我们证明了靶向 RNA 引导的 MGMT 启动子甲基化是一种有希望克服化学耐药性和改善 TMZ 在胶质母细胞瘤中的细胞毒性作用的工具。
利用工程重组酶将位点特异性 DNA 插入人类基因组
将大型 DNA 序列精确插入基因组的技术对于各种研究和治疗应用至关重要。大型丝氨酸重组酶 (LSR) 可以介导多千碱基 DNA 序列的直接、位点特异性基因组整合，而无需预先安装着陆垫，但目前的方法存在插入率低和脱靶活动率高的问题。在这里，我们提出了一个全面的工程路线图，用于联合优化 DNA 重组效率和特异性。我们结合定向进化、结构分析和计算模型来快速识别附加突变组合。我们通过供体 DNA 优化和 dCas9 融合进一步提高了性能，从而实现了同时招募目标和供体。顶级工程 LSR 变体在内源性人类基因座上实现了高达 53% 的整合效率和 97% 的全基因组特异性，并有效整合大型 DNA 货物（测试高达 12 kb），以在具有挑战性的细胞类型（包括非分裂细胞、人类胚胎干细胞和原代人类 T 细胞）中稳定表达。这种合理设计 DNA 重组酶的蓝图使得精确的基因组工程成为可能，而不会产生双链断裂。
使用高通量测量值在各种情况下开发紧凑的转录效应子
转录效应子是已知激活或抑制基因表达的蛋白质结构域。但是，缺乏对哪种效应域调节转录的系统性理解。在这里，我们开发了DCAS9介导的高通量募集（HT-RECRUIT），这是一种合并的筛选方法，用于量化内源性靶基因的效应子功能和测试效应子功能，用于包含各种环境的5,092个库中的库。我们还使用较大的文库瓷砖调节剂和转录因子来绘制从未注释的蛋白质区域绘制的效应子的上下文依赖性。我们发现许多效应子取决于目标和DBD上下文，例如可以充当激活因子或阻遏物的HLH域。为了实现有效的扰动，我们选择了包括ZNF705 KRAB在内的上下文固定域，从而改善了CRISPRI工具以使启动子和增强子保持沉默。我们通过结合NCOA3，FOXO3和ZnF473结构域来设计一种称为NFZ的紧凑型人类激活剂，该结构域可以通过更好的病毒递送和对嵌合抗原受体T细胞的诱导控制有效的CRISPRA。
用于序列特异性的抗间隔肽核酸……
尽管基于 CRISPR-Cas9 的技术得到了快速而广泛的应用，但用于调节剂量、时间和精度的便捷工具仍然有限。基于使用合成肽核酸 (PNA) 以异常高的亲和力结合 RNA 的方法，我们描述了向导 RNA (gRNA) 间隔区靶向或“反间隔区”PNA，作为以序列特异性方式调节细胞中 Cas9 结合和活性的工具。我们证明 PNA 可以快速有效地以低剂量靶向复合 gRNA 间隔区序列，并且不受序列选择性 Cas9 抑制的设计限制。我们进一步表明，短 PAM 近端反间隔区 PNA 可实现有效的切割抑制（减少超过 2000 倍），并且 PAM 远端 PNA 可改变 gRNA 亲和力以促进靶向特异性。最后，我们应用反间隔物 PNA 来对两个 dCas9 融合系统进行时间调控。这些结果提出了一种新颖的合理核蛋白工程方法，并描述了一种可快速实施的 CRISPR-Cas9 调节反义平台，以提高应用的时空多功能性和安全性。