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DNA 测序领域及其发展
反应混合物中包括DNA（反向）、脱氧核苷酸（dNTP）、双脱氧核苷酸（ddNTP，通常用不同的荧光染料标记）和热稳定性DNA聚合酶。首先，测序引物与 PCR 产物杂交，并在 PCR 过程中由 DNA 聚合酶延伸。 ddNTP 在延伸过程中被整合到 DNA 链中，从而终止序列上任何位置的链延伸。随后的毛细管电泳根据大小分离 DNA 链，并使用每种荧光染料识别终止的核苷酸。它被认为是突变分析的标准方法，可以确定整个序列并识别未知突变。肿瘤样本中低频率（< 10%）的突变无法使用桑格测序来确定。
核酸分析技术。......
图 12. Sanger 法。A) 双脱氧核苷酸 (ddNTP) 的结构与脱氧核苷酸 (dNTP) 相似，只是缺少 3'OH 基团。B) 当荧光标记的 ddNTP 被掺入 DNA 链时，合成会停止。在包含不同 ddNTP 的反应中，DNA 片段合成可以在不同点终止。然后根据大小分离合成产物，并使用荧光标记来确定序列中添加核苷酸的顺序。基因组很大 - 通常有数百万个碱基对 - 因此无法在一个步骤中端到端测序。要对基因组进行测序，必须首先将其 DNA 分解成较小的片段，并对每个片段进行单独测序。特定 DNA 片段的既定碱基顺序称为“序列读取”。然后利用计算工具组装各种片段并推断出起始基因组的序列。这个过程在历史上被称为“散弹枪测序”。人类基因组计划 (HGP) 是全基因组 DNA 测序的首次重大尝试，由美国国立卫生研究院牵头。HGP 于 2003 年完成，利用桑格测序法对来自多个个体的 DNA 的基因组克隆进行测序，以生成人类基因组的代表性序列。
DNA 测序
Sanger 测序或链终止或双脱氧方法基于 DNA 聚合酶的两个特性：聚合酶合成单链 DNA 模板的精确正确的互补拷贝，并且它们可以使用 2'，3'- 双脱氧核苷酸三磷酸 (ddNTP) 作为底物。双脱氧核苷酸的 3' 端缺少羟基并且只有氢，因此一旦该核苷酸在生长点被掺入链中，链的延长就会停止在 ddNTP 处并且不再充当链延长的底物。在实践中，使用 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段，因为它不具有 5'- 3' 外切酶活性，这是完整酶的特性。所有 DNA 合成都需要引物，因此化学合成的寡核苷酸被用作引物，该引物退火到靠近需要测序的序列的位置。 （克列诺片段是大肠杆菌的DNA聚合酶I被蛋白酶枯草杆菌蛋白酶酶切时产生的一个大的蛋白质片段，它保留了5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，用于去除预编码核苷酸并进行校对，但失去了5'→3'外切酶活性，即引物去除活性）。