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液滴数字PCR（DDPCR）的初学者指南
液滴数字PCR（DDPCR）已成为分子诊断中的一种变革性技术，在核酸定量中具有无与伦比的灵敏度和精度。通过将样品划分为数千滴，DDPCR可以实现数字方法进行DNA和RNA分析，克服传统PCR方法的局限性。这种微型审查强调了DDPCR在肿瘤学中的关键进步和应用，包括其在检测循环肿瘤DNA（CTDNA），拷贝数变化（CNV）和表观遗传生物标志物方面的效用。该技术鉴定罕见的遗传事件和Moni Tor肿瘤异质性的能力对癌症的诊断，治疗和监测产生了重大影响。此外，DDPCR在非侵入性液体活检中的作用及其在新兴领域的应用，例如CAR-T治疗监测和肿瘤微生物组分析，证明了其广泛的临床潜力。尽管诸如标准化和成本等挑战，但多重和自动化方面的持续进步有望扩大DDPCR的范围，从而进一步增强了其对个性化医学和分子肿瘤学的贡献。
开发三体一步RT-DDPCR方法作为VMIX™平台的定量效力测定
参考：Becker La等。自然2017; 544：367–71。缩写：AAV9：腺相关病毒血清型9； ALS：肌萎缩性侧索硬化； atxn2：ataxin 2; AVB-205：AAV9-MIR-ATXN2; CB7：鸡β-肌动蛋白启动子；简历：变异系数； HKG：家政基因； HPRT1：低黄嘌呤 - 瓜氨酸磷酸贝糖基转移酶； ITR：反向终端重复； KD：敲除； mirna：microRNA； MOI：感染的多样性； mRNA：Messenger RNA； RNA：核糖核酸； RPP30：核糖核酸酶P蛋白亚基P30； RT-DDPCR：逆转录液滴数字聚合酶链反应； TDP-43：TAR DNA结合蛋白43; VG：病毒基因组。致谢和披露：这项研究由Aviadobio Ltd. RL，JK，LR，RJ，RJ，LL，IB，IB，JI，JI，AB，AM，AM，HC，HC，MM，PB是Aviadobio Ltd. RJ的雇员和/或股东，与VMIX™Platform and aviaDobio Ltd.RJ命名为AVIADOBIO LTD。根据国际医学杂志编辑委员会（ICMJE）的建议，作者符合作者身份标准。医学写作和社论支持由英国Costello Medical的Calum Suggett提供，并由Aviadobio Ltd.
开发用于定量纯化样品中AAV病毒基因组的DDPCR方案
这项研究的目的是开发纯化样品中AAV病毒基因组的DDPCR方案。未包装的污染物DNA，以及其他来自生产质粒和/或细胞系中的DNA，需要在准确量化病毒基因组之前被消除。我们测试了几个方案，以便它们去除未包装的DNA的能力，同时保持准确的包装病毒基因组滴度。为此，我们将质粒DNA刺激到纯化的AAV2载体中，并评估了以下样品处理条件：（a）仅与DNasei孵育； （b）DNAsei孵育，然后再灭活，72°C热灭活，蛋白酶K处理，最后95°C热灭活； （c）与条件B相同，但在72°C而不是95°C（d）无样品预处理时进行最终热灭活。质粒和AAV基因组拷贝通过双链DDPCR（QX200液滴数字PCR系统，Bio-Rad）量化。与条件D相反，在未进行样品处理的情况下，与条件A和C条件A和C相比，在条件B和条件B中观察到较低的AAV2 VG滴度的趋势在条件A，B和C中未检测到质粒DNA（图1）。有趣的是，在条件A和C中都会发现可比较的VG滴度。在重复使用纯化的AAV9实验时，进行了类似的观察结果。
批准的练习设置
▪人口/预期用户； - 肿瘤学，传染病，遗传疾病，个性化医学和移植患者。▪将由医疗保健专业人员使用以下操作。▪通过临床环境： - 医院和专业诊所。▪使用条件： - 被怀疑或诊断患有特定疾病或疾病的患者，可以使用DDPCR系统上的目标测定法检测或监测。▪包含标准： - 具有特定遗传突变，生物标志物或遗传性遗传变异的患者已知与被诊断或监测的疾病或状况相关的患者。这些目标应具有临床相关性和确定的证据，以支持其用于诊断或预后目的的使用。▪排除标准： - 可能不足以测试的样品材料不足的患者。- 诊断环境或预期使用DDPCR的患者在临床上无关或适当。- 没有DDPCR分析靶向的特定遗传突变，生物标志物或遗传变异的患者。- 使用DDPCR的患者在其特定的诊断或治疗环境中不提供临床上有显着的好处或有助于决策。
ddPCR 策略检测携带单个变异点的基因编辑植物：技术可行性和解释问题
在欧洲市场上销售的基因编辑生物及其衍生食品和饲料产品属于 2001/18/EC 指令的范围。因此，专门检测和量化它们的可能性已成为优先事项。为此，基于 PCR 的方法（例如实时 PCR 和数字液滴 PCR）有望适用于基因编辑生物携带的单个变异点，即使在技术层面上可能具有挑战性。但是，还可能遇到与结果解释相关的其他问题。事实上，考虑到它可能通过自然或育种计划传播，这种单一变异的存在并不能自动证明基因编辑生物的存在。为了克服这一关键问题，我们提出了一个通用工作流程来开发和验证一种针对基因编辑生物的 PCR 方法，以针对其单个变异点。首先，基于计算机模拟分析，评估技术设计基于 PCR 的方法以及使用其单个变异点区分基因编辑生物的可能性。如果确认了这些参数，则将根据转基因检测的最低性能要求测试所开发的 PCR 方法的性能。通过开发一种专门针对携带单核苷酸插入的基因编辑大米的 2 重数字液滴 PCR 方法，成功地说明了所提出的一般工作流程的使用。因此，所提出的工作流程被视为支持主管部门进行食品和饲料可追溯性的关键工具。
通过 ddPCR 快速、精确地定量大片段 DNA 切除和倒位
重新混合或改编本材料用于任何目的，无需注明原作者。预印本（未经同行评审认证）在公共领域。它不再受版权限制。任何人都可以合法共享、重复使用，版权所有者已将此版本发布于 2020 年 4 月 14 日。；https://doi.org/10.1101/2020.04.13.039297 doi：bioRxiv 预印本