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繁殖 - Bioscientifica
范可尼贫血 (FA) DNA 损伤反应 (DDR) 通路调节重要的细胞过程，例如 DNA 复制、细胞周期控制和 DNA 损伤修复。本文我们表明，FANCD2 是 FA DDR 通路的关键成员，它与生殖细胞特异性 Prmt5/piRNA 通路的几个重要成分相互作用，这些通路协调对转座因子 (TE) 的抑制。通过使用标记纯原始生殖细胞 (PGC) 群体的 Pou5f1 -eGFP 报告小鼠，我们证明 FA 缺乏会导致 TE 的抑制解除、PGC 耗竭以及精子发生和卵子发生缺陷。Fancd2-KO PGC 表现出过度的 DNA 损伤并加剧细胞凋亡。从机制上看，我们观察到在 Fancd2-KO ; Pou5f1 -eGFP 和 Fanca-KO ; Pou5f1 -eGFP 胚胎的 E10.5 PGC 中，PRMT5 催化的 H2A/H4R3me2s 标记在 LINE1 TE 上显著减少。此外，我们利用 Fancd2-KI 模型表明，在 WT PGC 中，FANCD2 和 PRMT5 共同占据了 LINE1 的启动子，而在 FA 缺陷型（Fanca-KO）PGC 中，这种共同占据消失了。这些结果表明，FA 通路参与了早期 PGC 中的 TE 抑制，可能通过一种涉及 FANCD2 促进的、PRMT5 催化的抑制性 H2A/H4R3me2s 标记的机制来实现。生殖 (2020) 159 659–668
Plodia Pantry中有效的多动性Piggybac转基因...
虽然基于Piggybac转座子的转基因被广泛用于各种新兴模型生物，但其在黄油环和飞蛾中相对较低的换位速率却阻碍了其用于鳞翅目常规遗传转化的使用。在这里，我们测试了密码子优化的多活跃pigbac转座酶（hypbase）mRNA形式的适用性，以将转基因盒递送和整合到储藏室的基因组中。与供体质粒共同注射，成功整合了1.5 - 4.4 kb的表达盒，驱动荧光标记物EGFP EGFP，DSRED或EYFP与3XP3启动子中的眼睛和Glia中的EYFP。从72小时的胚胎和幼虫，pupae和携带隐性白眼突变的成年人中，可以从72小时的胚胎中检测到转基因在G 0中的体细胞整合和表达。总体而言，注射卵中有2.5％存活到具有镶嵌荧光的成年成年人中。随后的荧光G 0创建者脱离了3xp3 :: eGFP和3xp3 :: eyfp的单插入副本，并产生了稳定的同源线。表达3xp3 :: DSRED的G 0创始人的一小部分G 0的随机跨跨跨跨，产生了一个稳定的转基因线，以一个以上的转基因插入位点分离。我们讨论了如何使用hypbase在Plodia和其他飞蛾中产生稳定的转基因资源。
APOBEC3B 报告骨髓瘤细胞系识别导致 APOBEC3B 表达的 DNA 损伤反应途径
载脂蛋白 B mRNA 编辑酶催化多肽样 (APOBEC) DNA 胞嘧啶脱氨酶 3B (A3B) 是一种 DNA 编辑酶，可诱导多发性骨髓瘤和其他各种癌症的基因组 DNA 突变。APOBEC 家族蛋白高度同源，因此研究癌细胞中 A3B 的生物学尤其困难。为了轻松全面地研究 A3B 在骨髓瘤细胞中的功能，我们使用 CRISPR/Cas9 生成了 A3B 报告细胞，其中包含 3 × FLAG 标签和整合在 A3B 基因末端的 IRES-EGFP 序列。这些报告细胞稳定表达 3xFLAG 标记的 A3B 和报告基因 EGFP，并且这种表达会受到已知刺激物（例如 PMA）的增强。相反，shRNA 敲低 A3B 会降低 EGFP 荧光和 3xFLAG 标记的 A3B 蛋白水平。我们利用这些细胞系筛选了一系列抗癌疗法，并发现大多数常规疗法（如抗代谢药物或放射疗法）会加剧内源性 A3B 表达，但最近的分子靶向疗法（包括硼替佐米、来那度胺和埃罗妥珠单抗）不会加剧内源性 A3B 表达。此外，在用抗代谢药物治疗时，ATM、ATR 和 DNA-PK 的化学抑制会抑制 EGFP 表达。这些结果表明 DNA 损伤通过 ATM、ATR 和 DNA-PK 信号传导触发 A3B 表达。
裸露的二氧化硅作为亲和纯化的替代基质/...
基于低成本、储量丰富且环保的亲和基质的“绿色”蛋白质纯化/固定工艺非常可取。未改性的二氧化硅基质非常适合这些需求。由于富含组氨酸的二氧化硅结合肽经常在生物淘选实验中分离，因此这项工作旨在评估使用裸露二氧化硅作为纯化/固定 His 标记蛋白质的替代基质的可行性。对纯化的 His6 标记 EGFP 进行的吸附和解吸研究表明，在测试条件下，不同大小和孔隙率的裸露二氧化硅颗粒会结合，并且可以使用含有 L-精氨酸/L-赖氨酸的环保洗脱液进行洗脱。未标记的 EGFP 不会与这些基质结合。小规模批量纯化方案使用 Davisil 643 或 646 级硅胶作为亲和基质，Tris 缓冲盐水洗脱液中含有 0.5 M L-精氨酸 (pH 8.5)，仅经过一个洗脱步骤，便可从大肠杆菌裂解物中纯化出纯度高达 96% 的 His6-EGFP，回收率约为 70%。用二氧化硅结合肽 Car9 标记的 EGFP 以类似的纯度和产量回收。其他 His 标记蛋白也可以纯化到类似的纯度水平。该批量纯化方案的规模被证明是可扩展的。这些结果表明，未改性的二氧化硅基质可用于有效纯化 His 标记蛋白。由于双标记 His6-EGFP-Car9 的回收率仅为 30 – 55%，因此标签组合对于固定化目的而言是有利的。
电脉冲暴露减少了转导HEPG2细胞所需的AAV8剂量
我们证明，在存在增强的绿色荧光蛋白（EGFP）表达腺体相关病毒（AAV8）载体的情况下，将电场脉冲在体外施加到肝细胞，使给定的传输水平与HISPATOCYCYP相比，将腺相关的病毒量（AAV8）降低了50-折叠式的电气量不超过50-折叠量。 接触。我们在标准井板中的8个暴露条件下进行了48个实验观测。电脉冲暴露涉及具有375 V/ cm场强度的单个80-MS脉冲。我们的研究表明，电脉冲暴露会导致细胞中EGFP的表达增强，这表明转导效率提高。如果成功地转换为体内环境，在我们的研究中观察到的增强转导将是一种有希望的迹象，证明了AAV载体所需剂量的潜在减少。对电场脉冲对体外AAV转导的影响是重要的前一步。
摘要
方法 生成并表征了用 EGFP 标记的强力霉素 (Dox) 诱导的 TP53R273H 和 SV40LT 慢病毒。用这些慢病毒转导从 21 个手术切除的 G1/G2 GEP-NET 原发性或转移性组织中消化的细胞，以产生 Dox 诱导的转基因 PDO (GM PDO)。将用荧光素酶慢病毒转导的 PanNET 的 GM PDO 注入 NSG 小鼠的胰腺中，以产生原位 GM PDO 衍生的异种移植瘤 (GM PDX)。通过 WGS 和 RNA-seq 分析检查了 GM PDO 的遗传和生物学特征，并将其与其原始肿瘤细胞进行比较。通过测量 EGFP 荧光强度来量化在 Dox-on 和 Dox-off 条件下培养的 GM PDO 的细胞生长率。通过生物发光成像监测 GM PDX 的肿瘤生长。通过 IHC 染色测量了 GM PDO 中 Dox 开启和关闭条件下的 NET 标记物 Ki67、p53 (R273H) 和 SV40LT 的表达、其原始肿瘤和 GM PDX。
diatom nitzschia captiva的遗传转化方法
内共生症在海洋环境中是一种广泛且在生态上具有重要意义的现象。这些内共生伙伴如何发展为具有新细胞器的有机体，仍然是未知的，需要调查现代共生体。dinotoms，具有进化中间硅质质体的dinoflagellates，被认为是研究细胞器发生的出色模型，因为它们在连续三个但不同的阶段保持了。努力了解宿主的鞭毛藻 - 结合硅藻的关系受到了共生的任何一个成员的遗传转化方法的限制。为了解决这种缺陷，我们修改了现有的硅藻生物和共轭转化方法和硅藻nitzschia captiva的冷冻保存方案，这是kleptoplastic dinotom dinotom dinotom dinotom dinotom duinotom durinskia capensis的重要猎物。Through the use of Phaeo dactylum tricornutum, Cylindrotheca fusiformis, and native Nitzschia captiva diatom designed plasmids, we suc cessfully express and target EGFP to the cytosol, mitochondria, and plastids of N. captiva, and visualize these organelles inside D. capensis in vivo, allowing specific labeling and tracking of摄入后的细胞器和蛋白质。此外，我们尝试利用CRISPR/CAS9来瞄准引入的EGFP基因，但找不到成功基因编辑的证据。
NDP 外显子 2 区域 KO 报告模板...
图 S01：CRISPR/Cas9 编辑人类 iPSC。(A) 使用双 sgRNA（sg1 和 sg2）靶向外显子 2 两侧的区域来生成 HDR 介导的 NDP KO-GFP 报告系，使用带有 KO 报告模板的 PUC57 载体，由外显子 2 (5'UTR)-eGFP-P2A 盒组成，两侧是同源臂 (HA)，其中包括 PAM 位点突变和用于质粒线性化的 sgRNA 切割位点 (sg1-c 和 sg2-c)。在此过程中还生成了 NHEJ 介导的 NDP KO (NDP Δ exon2) 以及 NDP WT 同源克隆。(B) 使用类似方法生成 NDP WT-GFP 报告系。外显子 3 的 CDS 两侧的双 sgRNA（sg3 和 sg4）和含有修复模板的质粒，由外显子 3（CDS）-V5-P2A- eGFP 盒组成，两侧是同源臂，包括 PAM 位点突变和用于质粒线性化的 sgRNA 切割位点（sg3-c 和 sg4-c）。sgRNA，小向导 RNA；HDR，同源定向修复；KO-GFP，敲除报告基因；KO，敲除；WT，野生型；PAM，protoscpacer 相邻基序；UTR，非翻译区；CDS，编码序列；HA，同源臂；eGFP，增强型绿色荧光蛋白；P2A，猪 teschovirus-1 2A 自切割肽；V5，V5 标签。
suzukii果蝇中的高效诱导型CRISPR-CAS9基因靶向
摘要：斑点的果蝇（果蝇苏木木松木）是东亚的原生，但已成为对水果生产的全球威胁。近年来，在该物种中建立了CRISPR/CAS9靶向，允许进行功能性基因组和遗传控制研究。在这里，我们报告了D. suzukii表达Cas9菌株的产生和表征。使用含有EGFP荧光标记基因的Piggybac构建体生成了五个独立的转基因线，而在D. melanogaster Heat Hote Hote蛋白70启动子和3'UTR的控制下，Cas9基因在CAS9基因下产生。热震（HS）处理的胚胎，揭示了转基因CAS9表达的强热诱导性。通过将靶向EGFP的GRNA注入一条选定的线中，G 0倍的50.0％显示出镶嵌的荧光表型，而G 0倍的G 0倍产生的G 1突变体没有HS。通过应用HS，这种体细胞和种系诱变率分别增加到95.4％和85.7％。接受HS的父母植物导致其后代的突变遗传（92％）。另外，针对内源基因黄色导致色素沉着和男性致死性。我们讨论了这些效率和温度依赖性CAS9菌株的潜在用途用于铃木D. suzukii中的遗传研究。
用于超低剂量 CRISPR/Cas9 基因编辑的脂异肽复合物
评估了含有琥珀酰四乙烯五胺 (Stp) 和脂氨基脂肪酸 (LAF) 的双 pH 响应异种肽载体用于基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑。使用三种不同的基因组靶标（Pcsk9、eGFP、mdx 外显子 23），在三种不同的报告细胞系中筛选了不同的载体拓扑结构、LAF/Stp 比率的变化和 LAF 类型作为 Cas9 mRNA/sgRNA 多聚复合物。鉴定出一种 U 形和三种束 (B2) 形脂异种肽，它们表现出显著的效率。在亚纳摩尔 EC 50 浓度分别为 0.4 nM sgRNA 和 0.1 nM sgRNA 的顶级 U 形和顶级 B2 载体中，即使在全 (≥ 90%) 血清中孵育后，仍观察到顶级载体的基因组编辑效力。多聚复合物与单链 DNA 模板共同递送 Cas9 mRNA/sgRNA，用于同源性定向基因编辑，导致报告细胞中 eGFP 转化为 BFP 的比例高达 38%。顶部载体被配制成多聚复合物或脂质纳米颗粒 (LNP)，随后用于体内给药。制剂在 4 ◦ C 下储存时表现出长期的物理化学和功能稳定性。重要的是，静脉内注射多聚复合物或 LNP 介导肌营养不良蛋白基因的体内编辑，触发肌营养不良蛋白表达的心肌、骨骼肌和脑组织中 mRNA 外显子 23 剪接调节。