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化脓性链球菌 Cas9 核糖核蛋白递送，用于在锥虫和利什曼原虫中进行高效、快速和无标记的基因编辑
图 1 布氏锥虫 PCF 中的 GFP 失活。（a）对组成性表达胞浆 eGFP 的布氏锥虫进行荧光流式细胞术分析。在用 20 μ g（无 Cas9、Cas9/gRNA GFP1、Cas9/gRNA GFP2、Cas9/gRNA GFP3）或 60 μ g（Cas9/gRNA GFP2）来自 IDT 的 RNP 复合物转染后 24 至 72 小时随时间监测 GFP 荧光，条形图显示用不同向导转染后 72 小时 GFP 阴性细胞的百分比（n = 3）。采用 Prism 软件进行统计分析，采用 t 检验（非配对、正态分布、参数检验和双尾）。显着性水平（p 值）用星号表示。 （b）上图显示了允许 e Sp Cas9 在大肠杆菌中表达的质粒的示意图。蓝色框表示蛋白质 N 端和 C 端的两个多组氨酸序列，红色框表示 TEV 和肠激酶 (EK) 蛋白酶的切割位点，灰色框表示三个核定位信号 (NLS)，黑色框表示 FLAG 表位的三个重复，橙色框表示 e Sp Cas9 编码序列。下图显示了在用来自 IDT 或实验室纯化 (Lab) 的 RNPs 复合物 (无 Cas9、20 μ g Cas9/gRNA GFP2、40 μ g Cas9/gRNA GFP2、40、60 和 80 μ g Cas9/gRNA GFP2) 转染后 72 小时监测的表达 GFP 的 T. brucei 的荧光流式细胞术分析。（c）不再表达 GFP 的克隆中 GFP 基因的一部分的序列比较。该序列仅显示 GFP2 向导 RNA 所针对的区域。灰色框（H1 和 H2）突出显示可能用于 MMEJ 修复的同源区域。由实验室纯化的 Cas9 失活产生的序列和来自商业 Cas9 的序列分别标记为 Lab 和 IDT。下面显示了 Dc6 和 Ba10 克隆的相应色谱图（置信区间 95%— p 值样式：0.1234 (ns)；0.0332 (*)；0.0021 (**)；0.0002 (***)；< 0.0001 (****)）。
与遗传变异相关的基因组编辑脱靶的可扩展评估
1. 波士顿儿童医院血液科/肿瘤科、丹娜法伯癌症研究所儿科肿瘤科、哈佛干细胞研究所、麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所、哈佛医学院儿科系，马萨诸塞州波士顿 02115，美国
改进的主要编辑允许在 Physcomitrium patens 中进行常规可预测的基因编辑
高效、精准的基因编辑是任何反向遗传学研究的黄金标准。最近开发的 Prime Editing 方法，即改进的 CRISPR/Cas9 [成簇的规律间隔的回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白] 编辑方法，已经达到了精度目标，但其编辑率还有待提高。我们提出了一种改进的方法，可在模型植物 Physcomitrium patens 中进行常规 Prime Editing，同时探索潜在的新 Prime Editing 改进。使用标准化的原生质体转染程序，通过直接植物选择评估了针对 APT 报告基因的多种 Prime Editing 向导 RNA (pegRNA) 结构和 Prime Editor 变体。综合起来，Prime Editor 表达的增强、pegRNA 3ʹ 延伸的修改以及在 pegRNA 的逆转录酶模板序列中添加同义突变，可显著提高编辑率，而不会影响编辑质量。此外，我们表明，prime editing 可以通过间接选择来编辑目标基因，正如 Ppdek10 突变体的产生所证明的那样。此外，我们确定植物逆转录转座子逆转录酶能够实现 prime editing。最后，我们首次展示了使用两个独立编码的肽进行 prime editing 的可能性。
通过腺嘌呤碱基编辑高效生成具有明确 FecBB 突变的绵羊
摘要 碱基编辑有可能改善农业中的重要经济性状，并且可以精确地将 DNA 或 RNA 序列中的单个核苷酸转换为最小的双链 DNA 断裂 (DSB)。腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 是最近出现的用于将目标 A:T 转换为 G:C 的碱基编辑工具，但尚未在绵羊身上使用。ABEmax 是 ABE 的最新版本之一，它由催化受损的核酸酶和实验室进化的 DNA 腺苷脱氨酶组成。骨形态发生蛋白受体 1B (BMPR1B) 基因中的 Booroola 繁殖力 (FecB B) 突变 (g.A746G, p.Q249R) 会影响许多绵羊品种的繁殖力。在本研究中，通过使用 ABEmax，我们成功获得了具有确定点突变的羔羊，这些突变导致氨基酸替换 (p.Gln249Arg)。在新生羔羊中，定义的点突变效率为 75%，因为六只羔羊在 FecB B 突变位点 (g.A746G, p.Q249R) 处为杂合子，两只羔羊为野生型。我们在八只经过编辑的羔羊中未检测到脱靶突变。在此，我们报告了由 ABE 生成的首只基因编辑绵羊的验证，并强调了其改善牲畜经济重要性状的潜力。
通过基础编辑恢复血红蛋白功能的HBG-MAKASSAR安装：镰状细胞病的变革疗法
腺嘌呤碱基编辑提供了一种基于镰状细胞疾病（SCD）的可行基因疗法，将镰状血红蛋白（HBS，βε6V）转化为G-Makassar血红蛋白（HBG，βE6A），一种天然发生的，非致病变体。但是，单独使用HB的HBG功能在很大程度上没有表征。我们提出了一种用于表征纯化的HBG-MAKASSAR以及HBGG和HBGS红细胞功能的小鼠模型。纯化的HBG-makassar表现为功能性血红蛋白，包括在缺氧下无聚合。HBG-MAKASSAR的氧和脱氧状态的结构表征显示出血红蛋白折叠的拓扑结构与βε6α突变没有变化。 红细胞功能分析，缺氧下的疾病倾向，血液计数和线粒体保留措施将HBGS RBC作为HBAS和HBSS之间的严重程度中间，器官功能与HBA相当。 HBGG类似于大多数指标的HBAA。 总结我们的结果表明，直接校正HBS对HBG-Makassar可以为SCD提供变革性疗法。HBG-MAKASSAR的氧和脱氧状态的结构表征显示出血红蛋白折叠的拓扑结构与βε6α突变没有变化。红细胞功能分析，缺氧下的疾病倾向，血液计数和线粒体保留措施将HBGS RBC作为HBAS和HBSS之间的严重程度中间，器官功能与HBA相当。HBGG类似于大多数指标的HBAA。总结我们的结果表明，直接校正HBS对HBG-Makassar可以为SCD提供变革性疗法。
通过 LHCII 编码基因的多重基因组编辑揭示类囊体基粒堆积
HAL 是一个多学科开放存取档案库，用于存放和传播科学研究文献，无论这些文献是否已出版。这些文献可能来自法国或国外的教学和研究机构，也可能来自公共或私人研究中心。
对硅藻三角褐指藻中的长链酰基辅酶 A 合成酶家族进行多重 CRISPR/Cas9 编辑，发现线粒体 ptACSL3 参与了储存脂质的合成
Xiahui Hao、Wenchao Chen、Alberto Amato、Juliette Jouhet、Eric Maréchal 等人。硅藻 Phaeodactylum tricornutum 中长链酰基辅酶 A 合成酶家族的多重 CRISPR/Cas9 编辑表明，线粒体 ptACSL3 参与了储存脂质的合成。New Phytologist，2022 年，233 (4)，第 1797-1812 页。�10.1111/nph.17911�。�hal-03479559�
反义 RNA 上的 ADAR RNA 编辑导致重叠正义转录本上出现明显的 U 到 C 碱基变化
尽管迄今为止已描述了数百种 RNA 修饰，但只有 RNA 编辑会导致 RNA 分子的核苷酸序列与基因组相比发生变化。在哺乳动物中，迄今为止已描述了两种 RNA 编辑，即腺苷到肌苷 (A-to-I) 编辑和胞苷到尿苷 (C-to-U) 编辑。RNA 测序技术的最新改进导致发现越来越多的编辑位点。这些方法功能强大但并非没有错误，因此必须对新描述的编辑位点进行常规验证。在对 DDX58 mRNA 进行其中一次验证时，除了 A-to-I RNA 编辑位点外，我们还遇到了假定的 U-to-C 编辑。这些 U-to-C 编辑存在于几种细胞系中，并且似乎受到特定环境刺激的调节。在人类长基因间非编码 RNA p21 (hLincRNA- p21) 中也观察到了同样的发现。更深入的分析表明，假定的 U-to-C 编辑是由从相同基因座转录的重叠反义 RNA 上的 A-to-I 编辑引起的。此类编辑事件发生在以相反方向转录的重叠基因上，最近已被证明具有免疫原性，并与自身免疫和免疫相关疾病有关。我们的发现也得到了深度转录组数据的证实，表明此类基因座可以通过同一基因座内 A-to-I 和 U-to-C 错配的存在来识别，在正义转录本和顺式天然反义转录本 (cis-NAT) 中都存在反射性 A-to-I 编辑，这意味着此类簇可能是功能相关的 ADAR1 编辑事件的标志。
葡萄基因组编辑的新进展
© 作者 2024。开放存取本文根据知识共享署名 4.0 国际许可进行授权，允许以任何媒体或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的信任，提供知识共享许可的链接，并指明是否做了更改。本文中的图片或其他第三方资料包含在文章的知识共享许可中，除非资料的致谢中另有说明。如果资料未包含在文章的知识共享许可中，且您的预期用途不被法定规定允许或超出允许用途，则需要直接从版权所有者处获得许可。要查看此许可证的副本，请访问 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。知识共享公共领域贡献豁免（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）适用于本文中提供的数据，除非数据来源中另有说明。