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CRISPR/Cas9 介导双等位基因 F0 海葵鱼 (Amphiprion ocellaris) 突变体的产生
基因组操作是一种有用的方法，可用于阐明发育、生理和行为方面的分子途径。然而，由于缺乏适用于珊瑚鱼的基因编辑工具，因此它们许多独特特征的遗传基础仍有待研究。一种适合应用这种技术的标志性珊瑚鱼群是海葵鱼 (Amphiprioninae)，因为它们与海葵共生、雌雄同体、复杂的社会等级、皮肤图案发展和视觉，并且相对容易在水族箱中饲养，因此被广泛研究。在这项研究中，我们开发了一种基因编辑方案，用于将 CRISPR/Cas9 系统应用于眼斑海葵鱼 (Amphiprion ocellaris)。受精卵的显微注射用于证明我们的 CRISPR/Cas9 方法在两个不同靶位点的成功应用：与视觉有关的视紫红质样 2B 视蛋白编码基因 (RH2B) 和与黑色素生成的酪氨酸酶生成基因 (tyr)。对眼斑海马胚胎中测序的靶基因区域进行分析表明，注射胚胎的吸收率高达 73.3%。进一步分析亚克隆的突变基因序列并结合扩增子散弹枪测序表明，我们的方法在 F0 眼斑海马胚胎中产生双等位基因突变的效率为 75% 到 100%。此外，我们清楚地显示了 tyr 突变胚胎的功能丧失，其表现出典型的低黑色素表型。该方案旨在作为进一步探索 CRISPR/Cas9 在眼斑海马中潜在应用的有用起点。眼斑鱼，作为研究小丑鱼和其他珊瑚鱼基因功能的平台。
使用CRISPR-CAS9核糖核蛋白复合物
白内障是全球失明的主要原因。先天性或小儿白内障也可能导致永久性视力障碍或失明，即使尝试进行最佳尝试。很大一部分小儿白内障具有遗传原因。因此，识别导致白内障形成的基因对于理解遗传性小儿白内障的病理过程以及新疗法的发展至关重要。尽管基因组技术取得了明显进展，但对新鉴定的候选基因和变体的生物学效应的验证仍然具有挑战性。在这里，我们提供了一条逐步的管道，使用CRISPR-CAS9核糖核蛋白复合物（RNP）评估F0斑马鱼中的白内障候选基因。包括CRISPR-CAS9 RNP设计和配方的详细片段，微注射，CRISPR-CAS9 RNP RNP剂量和交付途径的优化，编辑功效分析以及白内障形成评估。遵循此协议，可以在2周内使用基本实验室供应在2周内轻松评估任何白内障候选者。
组织靶向 CRISPR-Cas9 介导的 F0 代 Xenopus laevis 胚胎中多个同源物的基因组编辑
Xenopus laevis 青蛙是一种强大的发育模型，可用于将经典胚胎学与分子操作相结合的研究。由于胚胎尺寸大、易于显微注射以及能够通过已建立的命运图谱靶向组织，X. laevis 已成为主要的两栖动物研究模型。鉴于它们的异源四倍体基因组使基因敲除的产生变得复杂，需要制定策略来有效地诱变多个同源基因以评估基因功能。在这里，我们描述了一种利用 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑来靶向 F 0 X. laevis 胚胎中的单个等位基因或多个等位基因的方案。单个向导 (sg) RNA 旨在靶向编码关键蛋白质结构域的特定 DNA 序列。为了诱变具有两个等位基因的基因，sgRNA 是针对两个同源基因共有的序列设计的。该 sgRNA 与 Cas9 蛋白一起被微注射到受精卵中，以破坏整个胚胎中的基因组序列或进入特定的胚泡，以产生组织靶向效应。CRISPR/Cas9 产生的 DNA 双链断裂的易错修复会导致插入和缺失，从而在胚胎内产生嵌合基因病变。对从每个嵌合 F 0 胚胎中分离的基因组 DNA 进行测序，并使用软件评估产生的突变的性质和嵌合程度。该方案能够敲除整个胚胎或 F 0 X. laevis 胚胎中特定组织中的基因，以便于评估产生的表型。
一种简单有效的 F0 敲除方法，用于快速筛选行为和其他复杂表型
摘要 数百种人类基因与神经系统疾病有关，但将其转化为可处理的生物机制却滞后。斑马鱼幼体是研究神经系统疾病遗传贡献的有吸引力的模型。然而，目前的 CRISPR-Cas9 方法难以应用于研究行为表型的大规模遗传筛选。为了促进快速遗传筛选，我们开发了一种简单的无测序工具来验证 gRNA，并开发了一种高效的 CRISPR-Cas9 方法，能够将 90% 以上的注射胚胎直接转化为 F0 双等位基因敲除。我们证明 F0 敲除可靠地重现复杂的突变表型，例如改变的昼夜节律分子节律、对刺激物的逃避反应以及多参数昼夜运动行为。该技术足够强大，可以敲除同一动物中的多个基因，例如创建用于成像的透明三重敲除水晶鱼。我们的F0敲除方法将斑马鱼从基因到行为表型的实验时间从数月缩短至一周。
使用Snudda
肠神经系统（ENS）提供了胃肠道（GI）的内在神经，该神经（GI）具有数百万个神经元和多种神经元亚型和神经胶质细胞的内在神经。ENS调节基本的肠道功能，例如运动，营养摄取和免疫反应，但有关控制ENS神经元规范和分化的基因的基本信息仍然很大程度上未知。ENS神经元数量和组成的缺陷会导致肠道功能障碍，使GI症状具有使人衰弱的症状，并且与例如Hirschsprung病，炎症性肠道疾病，自闭症谱系障碍和神经退行性疾病，例如帕金森氏病。大多数ENS疾病的遗传基础仍然未知。最近的转录组分析已经确定了许多用于调节ENS神经发生的候选基因。然而，对这些候选基因的功能评估显着滞后，因为它们在ENS神经发生中的作用进行了实验性测试是耗时且昂贵的。在这里，我们在斑马鱼中开发了快速，可扩展的F 0 CRISPR基因组编辑筛选，以确定哪些候选基因控制ENS中的神经元发育。概念验证实验针对已知的ENS调节剂SOX10和RET表观稳定突变体具有高效率和精确度，表明我们的方法可靠地使用F 0指导RNA注射的幼虫来识别ENS神经发生（F 0 Crispants）。然后，我们评估10个转录因子基因在调节ENS神经发生和功能方面的作用。靶向2-3个候选基因的引导RNA的池将Cas9蛋白共同注入到一个单细胞阶段PHOX2BB中：GFP转基因斑马鱼胚胎，以直接评估ENS神经元数量的定性变化与6天旧F 0旧F 0 Crispants相比。然后对表现出降低的ENS神经元数的清晰池的靶基因进行单独测试，以鉴定负责任的基因。我们确定了五个转录因子，这些转录因子显示ENS神经元的降低，表明对肠祖细胞细胞分化为ENS神经元。添加了一个简单有效的测试以进一步评估肠道变化，我们发现两个转录因子基因的功能丧失减少了通过肠道标记的荧光标记食物的肠道转运。总而言之，我们的新颖，多步骤但直接的CRISPR筛选方法在斑马鱼中可以测试ENS发育和疾病基因功能的遗传基础，这些遗传基础将促进对转录组，全基因组关联或其他ENS-OMICS研究而产生的流形候选基因的高通量评估。这种体内清晰的屏幕将有助于更好地理解脊椎动物中的ENS神经元发展调节，以及在ENS疾病中出现的问题。
有针对性的CRISPR-CAS9介导的F0屏幕标识了肠神经系统的建立涉及的基因
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证（未经同行评审证明）获得的是作者/资助者，他授予Biorxiv授予Biorxiv的许可，以永久显示预印本。这是该预印本版本的版权持有人，该版本发布于12月29日，2023年。 https://doi.org/10.1101/2023.12.28.573581 doi：biorxiv preprint
高可靠性/ES系列变频器
标准配置包含： 1个高速脉冲输出端子（支持0-50kHZ方波信号输出） 1（F0）/2（F1及以上）个数字量输出端子 1（F0）/2（F1及以上）个继电器输出端子 1（F0）/2（F1及以上）个模拟量输出端子（支持0-10V电压输出或0-20mA电压输出） 以下扩展为卡式： 3个数字量输出端子 3个继电器输出端子 3个模拟量输出端子，支持0-10V电压输出或0-20mA电压输出
普通话感知中声学特性的影响
了解第二语言（L2）学习者所面临的挑战对于有效的语言获取至关重要。这项研究调查了夸张的声学特性对促进英语说话者的普通话学习的影响。使用合成的音调刺激，我们通过三个关键修改系统地操纵了音高轮廓：扩展基本频率（F0），增加F0（女性语音）并延长整体持续时间。我们的目标是评估F0扩展，较高的F0，更长的持续时间以及各种音节对普通话的学习和概括的影响。参与者从事非自适应试用语调识别任务。混合效应逻辑回归模型用于分析学习阶段，声学因素和色调的准确性。的发现揭示了从训练到测试和概括阶段的准确性提高，表明感知训练对成人说英语的人的音调有效。音调1的出现是最容易感知的，而音调3则构成了最挑战，与既定的色调获取难度层次结构一致。对声学因子的分析突出了特定于音调的效果。扩展的F0对识别音调2和音调3是有益的，但对音调1和音调4。此外，较长的持续时间也表现出各种色调的各种效果，有助于识别音调3和音调4但阻碍音调1的识别。较高的F0对于音调2是有利的，但对于音调3。此外，音节MA促进了音调1和音调2的识别，但对于音调3和音调4。这些发现增强了我们对声学特性在L2音调感知中的作用的理解，并对设计有效的培训计划的设计有影响。
TDG CAS9-CKO策略
过程如下：在体外转录GRNA。cas9和grnas微注射到C57BL/6JGPT小鼠的受精卵中。受精卵被移植以获得通过PCR和靶标扩增子测序确认的阳性F0小鼠。通过与C57BL/6JGPT小鼠配对阳性F0产生小鼠获得稳定的F1生成小鼠菌株，并通过PCR和靶向Agplicon测序对所需的突变等位基因进行确认。
FGF10-CRISPR镶嵌突变体证明了基因剂量...
CRISPR/CAS9介导的基因编辑通常会产生创始人的产生（F0）小鼠，这些小鼠在靶向基因中表现出体细胞镶嵌。众所周知，成纤维细胞生长因子10（FGF10） - 否则小鼠表现出有害和无肺表型，而中间肢体表型（可变有缺陷的四肢）在FGF10 -CrispR F0小鼠中观察到。然而，尚未研究FGF10-马赛克突变体中的肺表型与肢体类型和基因型有关。在这项研究中，我们检查了FGF10靶向的F0小鼠中的可变肺Phe -notypes，以确定肺表型是否与功能性FGF10基因型的百分比相关。首先，根据先前的报告，在胚胎第16.5天（E16.5）上的FGF10 -Crispr F0胚胎分为三种类型：I型，无肢； II型，肢体缺陷；和III型，正常的四肢。软骨和骨染色表明，在腰带（I型），肾小管或Zeugopo-Dial区域（II型）中观察到肢体截断。对FGF10的深度测序 - Mutant基因组表明，I型I型的代码子的平均比例为8.3±6.2％，II型的25.3±2.7％，III类型为54.3±9.5％（在E16.5的平均值）突变体的平均值（平均平均值）突变体的平均标准误差。组织学研究表明，I型胚胎几乎没有所有肺裂片。在II型胚胎中通常没有其他裂片发育不良的肺叶。在III型胚胎中形成的所有肺叶。I型和II胚胎中末端小管的数量显着较低，但在III型胚胎中没有变化。这些识别2型肺泡2型上皮（AECII）细胞，已知在FGF10-Heletozygous突变体中降低，使用抗表面活性剂蛋白C（SPC）抗体进行免疫接种：在E18.5肺中，进行了AECII肺的数量，AECII与功能FFF相依赖于E18.5肺部。