XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search Systemfloxed
Cre/lox 调节条件性救援和失活......
摘要 在空间和时间上调节基因活性的能力对于研究发育过程中以及胚胎后过程和疾病模型中的细胞类型特异性基因功能至关重要。Cre/lox 系统已广泛用于对斑马鱼的基因功能进行细胞和组织特异性条件分析。然而，缺乏简单有效的分离稳定的 Cre/lox 调控斑马鱼等位基因的方法。在这里，我们应用了我们的 GeneWeld CRISPR-Cas9 靶向整合策略来生成可提供强大条件失活和拯救的 floxed 等位基因。通用靶向载体 UFlip 具有用于克隆位于 floxed 2A-mRFP 基因陷阱两侧的短同源臂的位点，被整合到 rbbp4 和 rb1 的内含子中。 rbbp4 off 和 rb1 off 整合等位基因导致强烈的 mRFP 表达、内源基因表达减少 99% 以上，并重现已知的 indel 功能丧失表型。Cre 的引入导致 floxed 盒的稳定倒位、mRFP 表达的丧失和表型挽救。rbbp4 on 和 rb1 on 整合等位基因与功能丧失突变相结合不会引起表型。Cre 的添加通过盒的稳定倒位、基因捕获和 mRFP 表达以及预期的突变表型导致条件性失活。神经祖细胞 Cre 驱动器用于条件性失活和表型拯救，以展示如何在特定细胞群中使用这种方法。这些结果共同验证了一种在斑马鱼中有效分离 Cre/lox 反应条件等位基因的简化方法。我们的策略为生成基因嵌合体提供了一种新的工具包，并代表了斑马鱼遗传学的重大进步。
酪氨酸羟化酶 TH-Cre 敲入大鼠
该模型在内源性酪氨酸羟化酶 (TH) 启动子的控制下表达 cre-重组酶，从而能够在多巴胺能神经元中进行特异性表达。该模型在 TH 开放阅读框的翻译终止后立即有 (IRES)-cre 的定向插入。TH-Cre 大鼠可用于需要组织特异性表达的应用，包括光遗传学和转基因 floxed 系育种。
暑期课堂上通过视觉选择对果蝇进行 CRISPR/Cas9 基因编辑
(A) 顶部：将目标 Gal4（深蓝色，顶部构建体）与编码 Cas9 的版本 2 (V2) 供体菌株杂交，该菌株由 X 上的 vasa 启动子控制（未显示），而 CyO 上的供体构建体则包含 T2A。LexA 由 floxed 3xP3-RFP、黄色+ 盒标记，两侧是 Gal4 同源臂和 U6 驱动的向导 RNA（CyOHACKy.V2,y +、RFP +）。从上往下第三行：得到的 HACKed 染色体，其中 Gal4 ORF 已被破坏并由 T2A.LexA 替换，由视觉标记黄色+和 RFP+标记。底部：与 hs- Cre 杂交后，黄色 +、RFP + 盒被移除。
科学期刊
这里，我们报告了一种基于单个抗铁蛋白纳米抗体-TRPV1 受体融合蛋白的磁致系统，该系统在暴露于磁场时调节神经元活动。腺相关病毒 (AAV) 介导将 floxed 纳米抗体-TRPV1 递送到腺苷-2a 受体-Cre 驱动器的纹状体中，当放置在磁共振成像机中或靠近经颅磁刺激装置时，会导致运动冻结。功能成像和光纤光度测定证实了对磁场的反应激活。在野生型小鼠的纹状体中表达相同的构建体以及将表达 Cre 的 AAVretro 第二次注射到苍白球中导致相似的电路特异性和运动反应。最后，产生了一个突变来门控氯离子并抑制神经元活动。在 PitX2-Cre 帕金森病小鼠的丘脑底核中表达这种变体导致 c-fos 表达和运动旋转行为减少。这些数据证明磁致结构可以使用临床可用的设备在体内非侵入性地双向调节特定神经回路的活动。
一种由内源性 Lcn9 启动子驱动的附睾起始节段特异性表达 Cre 重组酶的新型小鼠系
从睾丸释放的精子经历成熟过程并通过附睾运输获得使卵子受精的能力。附睾分为四个区域，每个区域都有独特的形态、基因谱、腔内微环境和截然不同的功能。为了研究附睾起始节（IS）中相关基因的功能，通过 CRISPR/Cas9 技术建立了一种新的 IS 特异性小鼠模型——Lcn9-Cre 敲入（KI）小鼠系。TAG 终止密码子被 2A-NLS-Cre 盒替换，导致 Lcn9 和 Cre 重组酶共表达。从出生后第 17 天首次观察到 IS 特异性 Cre 表达。使用 Rosa26 tdTomato 报告小鼠，Cre 介导的 DNA 重组仅在主细胞中检测到。使用 Lcn9-Cre 小鼠与携带 Tsc1 floxed 等位基因 (Tsc1 flox/+) 的小鼠品系杂交，进一步证实了附睾 IS 特异性 Cre 体内活性。Cre 表达不影响正常发育或雄性生育力。与之前报道的任何附睾特异性 Cre 小鼠不同，新型 Lcn9-Cre 小鼠品系可用于引入整个 IS 特异性条件基因编辑以进行基因功能研究。
使用I-Gonad方法
CRE/ LOXP系统是体内基因功能研究的强大工具。CRE重组酶的调节表达以空间和时间控制的方式介导了遗传因素的精确缺失。尽管该系统具有鲁棒性，但仍需要大量精力为每个感兴趣的单个基因创建有条件的敲除模型，在这些基因中，必须同时将两个LOXP位点插入顺式。当前的工作涉及劳动密集型胚胎（ES）细胞 - 基于基因靶向小鼠胚胎的基因和乏味的微观畅通。该工作流的复杂性构成了技术挑战，因此限制了有条件遗传学的更广泛应用。在这里，我们通过将CRISPR供体的独特设计与新的Oviduct电穿孔技术I I -Gonad集成了一种替代方法来生成鼠标LOXP等位基因。显示了这种方法的潜力和简单性，我们在一次尝试中创建了五个基因的FloxErx等位基因，其成本相对较低，设备设置最少。除了条件等位基因外，还获得了本构敲除等位基因作为这些实验的副产品。因此，I -Gonad的更广泛应用可能会使用新型鼠模型促进基因功能研究。
在胚胎，幼虫和成年斑马鱼中高效的他莫昔芬可诱导的Cre重组
在成人生物体中灭活基因功能的能力对于研究诸如再生和行为等生物学过程至关重要。这是通过工程化等位基因来实现的，该等位基因可以使用CRE重组酶有条件地灭活，然后使用药物诱导的CRE重组酶灭活基因功能。最近的一些研究清楚地表明，工程在斑马鱼中的有条件等位基因的可行性。同时，实现足够程度的重组以诱导完全丧失功能的丧失仍然是一个主要限制。在此，我们通过设计由斑马鱼β-Actin2基因的内含子增强子的斑马鱼泛素启动子组成的重组泛素启动子UBB R来解决这一限制。使用PHIC31介导的靶向集成，我们证明了UBB R在所有胚胎和幼虫阶段测试的UBB R显然均优于父母启动子以及目前可用的无处不在的Creer T2驱动线。此外，我们生成的UBB R：CRER T2驱动线使成人斑马鱼心中的Floxed等位基因几乎完全失活。最后，我们证明了我们的UBB R启动子在其他基因组基因座集成时会保留高活性，从而使其独特地适合于斑马鱼的所有阶段的转基因表达。
可差异的CRE重组酶允许在Berghei疟原虫的蚊子阶段进行有条件的基因组编辑
疟原虫的无性血液阶段很容易通过同源重组来适应遗传修饰，从而使寄生虫基因的功能性研究在生命周期的这一部分中并非必不可少。然而，常规的反向遗传学不能应用于无性血液阶段复制中必不可少的基因的功能分析。已经开发了各种策略，用于浆细胞的条件诱变，包括基于重组酶的基因缺失，可调节启动子以及mRNA或蛋白质破坏稳定系统。在其中，可二聚Cre（DICRE）重组酶系统已成为p中有条件基因缺失的强大方法。恶意。在该系统中，噬菌体CRE以两种单独的酶无活性多肽的形式表达，每种酶融合了不同的雷帕霉素结合蛋白。雷帕霉素诱导的两个成分的异二聚化恢复重组酶活性。我们已经在啮齿动物疟原虫p。berghei，并表明可以在哺乳动物和蚊子寄生虫阶段具有很高的效率来实现雷帕霉素诱导的floxed DNA序列切除。此工具可用于投资基本基因的功能，不仅在无性血液阶段，而且在疟原虫生命周期的其他部分。
利用 i-GONAD 进行多次连续基因组编辑和育种富集有助于生产转基因小鼠
摘要：转基因 (GM) 小鼠是生物医学研究中必不可少的工具。传统的转基因小鼠生成方法成本高昂，需要专门的人员和设备。使用成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 结合改进的输卵管核酸递送基因组编辑 (i-GONAD) 大大提高了在研究实验室中生产转基因小鼠的可行性。然而，由于 C57BL/6 (B6) 等近交系小鼠的生育能力低且胚胎脆弱，对其进行基因改造仍然具有挑战性。我们在尝试优化 i-GONAD 的同时，已在 B6 背景下成功生成了多种新型转基因小鼠品系。我们发现 i-GONAD 减少了超排卵怀孕雌性的产仔数，但不会影响怀孕率。自然交配或低激素剂量不会增加超排卵 B6 雌性中观察到的低生育率。然而，饮食丰富对怀孕成功有积极影响。我们还通过将接受 i-GONAD 治疗的怀孕 B6 雌性与同步怀孕的 FVB/NJ 伴母共同饲养来优化繁殖条件，以提高幼崽的存活率。因此，通过丰富的饮食和与生育能力强的雌性（如 FVB/NJ）共同抚养幼崽，增加了转基因小鼠的产生。在本研究中，我们使用 CRISPR/Cas 系统同时或连续靶向单个和多个基因座，产生了 16 只转基因小鼠。我们还比较了使用不同方法插入 LoxP 以产生条件性敲除小鼠的同源定向修复效率。我们发现，两步连续 LoxP 插入（其中每个 LoxP 序列在不同的 i-GONAD 程序中单独插入）是一种低风险、高效的产生 floxed 小鼠的方法。
IHC-2023-ABSTRACTs.pdfIHC-2023-ABSTRACTs.pdf
蛋白质，i）CLR，II）ramp1和iii）CGRP受体成分蛋白（RCP），这是通过G A S途径发出信号所需的细胞内周围膜蛋白。虽然当前的疗法集中于拮抗CGRP或CLR/RAMP1复合物，但我们投资了CGRP-RCP的损失会导致运动引起的恶心疼痛。方法：我们已经生成了CRCP基因第二外显子的LOXP条件的小鼠。然后，我们用Nestin-creer小鼠将这些CRCP-LoxP小鼠越过，导致他莫昔芬诱导后的神经元RCP表达障碍的小鼠。他莫昔芬诱导的CRCP-loxp小鼠未表达CRE作为对照。在他莫昔芬诱导后，两组小鼠在运动引起的恶心的测定中进行了测试。Mice were assessed after intraperitoneal (IP) injections of: i) vehicle-PBS, ii) CGRP (0.1 mg/kg), or iii) CGRP (0.1 mg/kg) co-delivered with either olcegepant (1.0 mg/kg-CGRP-receptor antago- nist) or rizatriptan (1.0 mg/kg-selective serotonin receptor激动剂）。结果：我们观察到CGRP增加了运动诱发的恶心，而Olcegepant（但不是Rizatriptan）能够减轻CGRP在他莫昔芬治疗的对照小鼠（N¼11F/11M）中的影响。有趣的是，floxed cgrp-rcp null（ - / - ）小鼠的反应类似于对照对照，但olcegepant和rizatriptan均未减轻CGRP的效果（n¼11f/11m）；表明不存在CGRP-RCP会使受体对拮抗剂Olcepant没有反应。致谢：这项研究得到了NIH R01 DC017261（AEL）和罗切斯特大学旋转格兰特（IMD）的支持。披露利息：无声明结论：总而言之，我们的发现表明：i）系统CGRP增加了缺乏神经元CGRP-RCP的对照和小鼠运动引起的运动引起的恶心； ii）细胞内CGRP-RCP的丧失会使CLR/ RAMP1复合物对OlcePant不敏感，从而显示出CGRP受体处的反抗偏见。