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通过 TRAP-seq 对细胞中的 CRISPR 编辑进行大规模并行量化，可以更好地设计出高效、准确的 Cas9、ABE、CBE gRNA
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者，此版本于 2020 年 5 月 21 日发布。；https://doi.org/10.1101/2020.05.20.103614 doi：bioRxiv 预印本
基于机器学习的 CRISPR gRNA 设计
通过诱导有害外显子跳跃来恢复基因功能已被证明可有效治疗遗传疾病。然而，许多临床上成功的外显子跳跃疗法都是基于寡核苷酸的短暂疗法，需要频繁给药。基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑可导致外显子跳跃，是一种有前途的治疗方式，可以永久缓解遗传疾病。我们表明，机器学习可以选择破坏剪接受体并导致目标外显子跳跃的 Cas9 向导 RNA。我们通过实验测量了小鼠胚胎干细胞中 1,063 个向导 RNA 靶向的 791 个剪接序列的多样化基因组整合文库的外显子跳跃频率。我们发现，当使用阈值预测的外显子跳跃频率分别为 50% 和 70% 时，我们的方法 SkipGuide 能够以 0.72 和 0.91 的精度识别有效的向导 RNA。我们预计 SkipGuide 将有助于选择用于评估 CRISPR-Cas9 介导的外显子跳跃疗法的引导 RNA 候选物。
multicrispr：用于主要编辑和数千个目标的并行定位的 gRNA 设计
近年来，通过 Crispr/Cas9 技术靶向编码基因组引入单核苷酸缺失/插入已成为一种标准程序。它迅速催生了多种方法，例如 Prime Editing、Crispr/Cas9 辅助 APEX 邻近标记蛋白质或同源定向修复 (HDR)，但支持这些方法的生物信息学工具却落后了。新应用通常需要特定的向导 RNA (gRNA) 设计功能，而通用的 gRNA 设计工具却严重缺失。在这里，我们回顾了 gRNA 设计软件并介绍了 multicrispr，这是一种基于 R 的工具，旨在设计单个 gRNA 以及并行靶向许多基因组位点的 gRNA 库。该软件包易于使用，可检测、评分和过滤 gRNA 的效率和特异性，可视化和汇总每个目标或 Crispr/Cas9 序列的结果，最后返回基因组范围以及首选的、无脱靶 gRNA 序列。为了通用，multicrispr 定义并实施了一个基因组算法框架，作为轻松适应尚未出现的技术的基础。其性能和新的 gRNA 设计概念（例如针对 gRNA 库的目标集特定过滤）使 multicrispr 成为处理类似筛选方法时的首选工具。
当前的 gRNA 排序预测算法对植物基因组编辑有用吗？
通过传统育种将新特性引入作物通常需要几十年的时间，但最近开发的基因组序列修饰技术有可能加速这一过程。这些新育种技术之一依赖于 RNA 指导的 DNA 核酸酶 (CRISPR/Cas9) 在体内切割基因组 DNA，以促进序列的删除或插入。这种序列特异性靶向由向导 RNA (gRNA) 决定。然而，选择最佳 gRNA 序列有其挑战。几乎所有当前用于植物的 gRNA 设计工具都是基于动物实验数据，尽管许多工具允许使用植物基因组来识别潜在的脱靶位点。在这里，我们检查了八种不同的在线 gRNA 位点工具的预测一致性和性能。不幸的是，不同算法的排名之间几乎没有共识，排名与体内有效性之间也没有统计学上显着的相关性。这表明，影响植物中 gRNA 性能和/或靶位点可及性的重要因素尚未阐明并纳入 gRNA 位点预测工具中。
CRISPR/Cas9 gRNA 载体
• 并行使用至少两个独立的 gRNA 序列来获得不同的克隆。通过基因组编辑创建的模型使用不同的 gRNA，这些 gRNA 共享靶位点，但不共享脱靶位点，是创建独立重复的绝佳方法。 • 为每个使用的 gRNA 分离多个独立的克隆细胞群。在独立克隆中，脱靶 DSB 发生在相同位点的可能性非常低。 • 虽然很少有实验室有资源进行统计上强大的全基因组测序验证协议（例如 gUIDEseq），但相对容易地为每个您使用的 gRNA 选择几个预测的脱靶序列，然后围绕这些位点进行测序，以确保没有引入脱靶插入/缺失。
有效地递送活性Cas9蛋白和靶标特异性SGRNA到广泛的细胞类型
最后，在悬浮液中生长的Jurkat细胞中，评估了吉赛克的敲除生理相关的内源基因。敲除靶向的CD81，该CD81编码在许多哺乳动物细胞中表达的细胞表面蛋白，并与丙型肝炎，HIV和流感发病机理有关。jurkat细胞用Cas9和CD81特异性SGRNA的表达质粒共转染，或用靶向CD81的Cas9 -Sgrna RNP复合物预加载的gesiles处理。通过抗体标记评估CD81的基因敲除效率，然后进行流式细胞仪分析（图4）。基于质粒的递送导致效率非常低。只有7％的细胞损失CD81表达。相反，吉塞拉（Gesicles）具有很高的效率，其中76％的Jurkat细胞缺乏可检测到的CD81水平。因此，吉质的表现优于基于质粒的技术，具有在难以转化细胞中有效靶向内源基因的能力。
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CRISPR/CAS9基因组编辑用于破坏HeLa细胞中的CXCR4基因座。CXCR4编码与CXCL12趋化因子相互作用的细胞表面趋化因子受体，并在免疫系统中起重要作用。在本实验中，使用指南IT SGRNA筛选试剂盒测试了针对CXCR4基因座的四个不同的SGRNA。简要地，使用指南SGRNA在体外转录试剂盒中合成了针对CXCR4基因的SGRNA。一个包含SGRNA靶序列的PCR片段与重组Cas9蛋白和每个SGRNA混合。通过琼脂糖凝胶电泳分析裂解反应。光密度法（Cong等，2013）表明SGRNA3的裂解效率最低（图2）。
crispys：使用CRISPR系统编辑基因家族的多个成员的最佳SGRNA设计
近年来CRISPR - CAS9系统的开发使真核基因组编辑，特别是用于反向遗传学的基因敲除，这是一个简单有效的任务。该系统通过与之基础对的编程单个指定RNA（SGRNA）有关，将其引导到基因组目标位点，随后导致特定于位点特定的修改。然而，真核基因组中的许多基因家族表现出部分重叠的功能，因此，一个基因的敲除可能被另一个基因的功能隐藏。在这种情况下，CRISPR – Cas9系统的特异性降低，这可能会导致与SGRNA不相同的基因组位点的修改，可以同时敲除多个同源基因的同时敲除。我们介绍了Crispys，这是一种用于SGRNA最佳设计的算法，该算法可能针对给定基因家族的多个成员。crispys首先将输入序列中的所有潜在目标簇列为层次树结构，该结构指定了它们之间的相似性。然后，通过在需要的地方嵌入不匹配的情况下，在树的内部节点中提出了SGRNA，以使编辑诱导目标的效率最大化。我们建议使用几种设计最佳单个SGRNA的方法，以及一种计算实验平台允许多个以上的情况下的最佳SGRNA集合的方法。后者可以选择说明基因家庭成员之间的同源关系。我们进一步表明，通过在Solanum lycopersicum基因组中的所有基因家族中，通过在计算机检查中，CRISPYS优于基于比对的技术。©2018 Elsevier Ltd.保留所有权利。
指南 - IT SGRNA体外转录套件产品组件列表
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