XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search Systemgal4
暑期课堂上通过视觉选择对果蝇进行 CRISPR/Cas9 基因编辑
(A) 顶部：将目标 Gal4（深蓝色，顶部构建体）与编码 Cas9 的版本 2 (V2) 供体菌株杂交，该菌株由 X 上的 vasa 启动子控制（未显示），而 CyO 上的供体构建体则包含 T2A。LexA 由 floxed 3xP3-RFP、黄色+ 盒标记，两侧是 Gal4 同源臂和 U6 驱动的向导 RNA（CyOHACKy.V2,y +、RFP +）。从上往下第三行：得到的 HACKed 染色体，其中 Gal4 ORF 已被破坏并由 T2A.LexA 替换，由视觉标记黄色+和 RFP+标记。底部：与 hs- Cre 杂交后，黄色 +、RFP + 盒被移除。
PGBKT7 DNA-BD矢量分析证书
描述PGBKT7是一种酵母表达载体，旨在表达GAL4 DNA结合结构域（DNA-BD;氨基酸1-147）和诱饵蛋白的融合蛋白。融合蛋白来自培养基ADH1启动子的高水平表达。融合蛋白还包含一个C-MYC表位标签。为了促进体外转录/翻译，PGBKT7包括GAL4 DNA-BD和表位标签之间的T7启动子。
Josephson辐射的隆期检测
图S3。用于检测HPNPO的抗体似乎无法识别果蝇PNPO。（a）普遍存在的SGLL敲低（基因型：actin -gal4/uas -SGLL RNAI）和对照曲线（基因型：actin -gal4/+和uas -sgll rnai/+）中的SGLL mRNA水平。n =每个基因型4。误差线代表平均值±SEM。* P <0.05。单向方差分析与Tukey的邮政为HOC。（b）具有各种基因型的成人头部匀浆的蛋白质印迹。n =每个基因型2。微管蛋白是负载对照。从所有三种基因型中检测到一种结合。这个乐队的大小似乎是正确的；果蝇PNPO的预测分子量（约27 kDa）。然而，SGLL敲低频率中的带强度与两个对照中的带强度相同，表明该频带不太可能是果蝇PNPO。
一种用于检测蛋白质的酵母交配选择方案
最近，出现了一种新的蛋白质蛋白质相互作用研究的方法。可以使用田野和同事开发的“两杂交系统”（1，2）来寻找新的相互作用蛋白质，或者验证和表征可能会根据遗传或生物化学数据关联的蛋白质之间的相互作用。两种杂交系统是一种分子遗传方法，它利用酵母转录因子GAL4的结构柔韧性。GAL4蛋白包含两个结构域，即DNA结合域和转录激活剂结构域。这两个结构域不必成为同一蛋白的一部分来完成转录激活（3）。当两个结构域分别融合到两个无关但相互作用的蛋白质时，由于蛋白质 - 蛋白质相互作用，可以实现转录激活。通常，使用两种杂交系统对新的相互作用蛋白进行搜索是通过将含有UASC的集成拷贝的酵母菌菌株共转换。1J-LACZ报告基因和两个质粒（2，4-6）。一个质粒编码GAL4的DNA结合结构域与感兴趣的蛋白质的融合，而另一个质粒（库质粒）编码GAL4转录激活结构域的融合以随机生成的编码区域。因此，DNA结合结构域融合将与报告基因上游的UASGAL元件结合。如果由文库融合质粒编码的蛋白质与感兴趣的蛋白质相互作用，则转录激活结构域成为报告基因上游的共定位，从而导致转录激活。有效使用两个杂交系统需要产生大量的酵母转化体。由于酵母的转化仍然比细菌的效率低四个数量级，因此对于详尽的cDNA文库筛网来说，转化可能是限制步骤。在本文中，我们设计了一种简单的方法，可以消除对转化的需求，并允许用户搜索
扩展果蝇工具包，用于双重控制基因表达的Jonathan Zirin 1，*，Barbara Jusiak 2，†，Raphael Lopes 1，†，Ben Ewen-campen 1
扩展果蝇工具包，以双重控制基因表达的乔纳森·齐林1，*，芭芭拉·朱西亚克2，†，拉斐尔·洛佩斯1，†，本·埃文（Ben Ewen）校园1，贾斯汀·A·博斯奇1，贾斯汀·A·博世（Justin A.马萨诸塞州波士顿，哈佛医学院，哈佛医学院2）生理学与生物物理学系，加利福尼亚大学，欧文，加利福尼亚州3）霍华德·休斯医学院，马萨诸塞州波士顿 *相应的作者†这些作者对这项工作的摘要同样贡献了在两种不同的组织中，在同一动物中进行了两种不同的组织，尤其是在同一动物中，尤其是一项阶级。通过结合GAL4/UAS和第二个二元表达系统（例如Lexa-System或QF系统）的技术使这种研究成为可能。在这里，我们描述了一种试剂资源，该试剂促进了在各种果蝇组织中综合使用GAL4/UAS和第二个二元系统。专注于具有良好特征的GAL4表达模式的基因，我们通过CRISPR敲击产生了一组40多个Lexa-Gad和QF2插入，并验证了它们在幼虫中的组织特异性。我们还构建了单个向量中编码QF2和Lexa-GAD转录因子的构造。成功地集成了该构建体中的蝇基因组后，使用FLP/FRT重组来隔离仅表达QF2或Lexa-GAD的飞行线。最后，使用新的兼容shRNA矢量，我们评估了Lexa和QF系统用于体内基因敲低，并正在生成此类RNAi飞行线的库作为社区资源。2007;珀金斯等。 2015）。2007;珀金斯等。2015）。一起，这些Lexa和QF系统向量和飞行线将为需要以同一动物以正交方式激活或抑制两个不同基因的研究人员提供一组新的工具。简介组合二进制系统使用RNAi或CRISPR的功能丧失（LOF）和功能增长（GOF）研究的大多数试剂依赖于GAL4/UAS介导的表达（Brand and Perrimon 1993; Dietzl等人。2015; Zirin等。2020;港口和布特罗斯2022）。但是，一些研究，例如对细胞间或器官间通信的研究，需要同时使用两个独立的二元转录系统。例如，双重表达系统已被用来研究果蝇胰岛素样肽如何与大脑释放以控制器官生长（Colombani等人。2015），分析从嗅觉神经元到血细胞的信号传导（Shim等人2013），独立操纵配体产生和配体接收细胞（Yagi等2010），并可视化组织中克隆细胞种群之间的相互作用（Bosch等人基于需要同时操纵给定组织中不同细胞的集合，Lexa/Lexaop系统（Lai and Lee 2006）和QF/Quas System（Potter等人2010; Potter and Luo 2011）已开发。没有系统的研究比较这两个系统，只有轶事证据支持一个系统。
通过优化SGRNA ...
摘要aflysam/crispra系统最近已成为果蝇果蝇（Drosophila Melanogaster）的功能性研究的强大工具。该系统包括GAL4/UAS驱动的DCAS9激活剂和U6促进器控制的SGRNA。建立了超过其他组合的DCAS9激活剂，以进一步提高靶向激活剂的效率，我们系统地优化了SGRNA的参数。有趣的是，发现最有效的SGRNA在转录起始位点（TSS）上游的-150bp到-450bp的区域积累，并且激活效率显示与SGRNA靶向序列的GC含量的正阳性相关性很强。此外，目标区域主要是GC含量，因为SGRNA的靶向区域超过-600BP，即使含有75％的GC，TSS的SGRNA都会降低效率。令人惊讶的是，当将靶向sgrNA的活性与DNA链的活性进行比较时，靶向非模板链的SGRNA靶向均优于互补的模板链，无论是在细胞和体内。总而言之，我们定义了SGRNA设计的标准，这将极大地促进CRISPRA在功能奖励研究中的应用。
果蝇组织特异性 CRISPR 诱变的大规模资源
摘要 基因筛选是基因组功能注释的有力工具。在多细胞生物中，允许在空间和时间上控制基因消除的方法极大地促进了基因功能的探究。在这里，我们描述了一个大规模转基因短向导 (sg) RNA 文库，用于以组成性或条件性方式有效地基于 CRISPR 破坏特定靶基因。该文库目前由 2600 多个质粒和 1700 个果蝇系组成，重点是靶向激酶、磷酸酶和转录因子，每个都在 Gal4/UAS 系统的控制下表达两个 sgRNA。我们表明，条件性 CRISPR 诱变在许多靶基因中都很有效，并且可以有效地用于各种体细胞组织以及生殖系。为了防止通常与过量 Cas9 蛋白相关的假象，我们开发了一系列新型 UAS-Cas9 转基因，这些转基因允许对 Cas9 表达进行微调，以实现高基因编辑活性，而不会产生可检测的毒性。功能测定以及基因组 sgRNA 靶位点的直接测序表明，绝大多数转基因 sgRNA 系可介导有效的基因破坏。此外，我们在所有后生动物中进行了迄今为止最大的完全转基因 CRISPR 筛选，这进一步证明了我们文库的高效率和准确性，并揭示了许多迄今为止尚未鉴定的发育必需基因。
DNA-PKCS信号的深入映射发现其激酶特异性的保守特征CBF表达1（ICE1）的诱导剂促进冷 - 2024.12.30.630795.full.pdfCBF表达1（ICE1）的诱导剂促进冷 -2024.12.30.630795.full.pdf
图1。神经元中VPS13的丧失导致年龄增强运动缺陷。（a）果蝇中组织特异性敲低的示意图。使用泛神经元驱动器elav-gal4进行神经元（红色）的特定敲低（红色）。使用Pan-Muscle驱动器24B-GAL4进行肌肉（蓝色）的特定敲低（蓝色）。（b）在无处不在（ACT-GAL4），神经元特异性（ELAV-GAL4）或肌肉特异性（24B-GAL4）敲低的（b）表现为成年的百分比，与基因型匹配的对照（GAL4具有UAS-luciferase（Luc）（Luc）相比，VPS13的肌肉特异性（24B-GAL4）敲低。 n≥50个基因型分析的动物。 （c）示意图描绘了成人飞行攀岩测定法，示例为100％攀爬（左）和50％攀爬（右）。 在实验中，分析了N〜10的组。 （D-E）在3-4天旧的神经元特异性（D）或肌肉特异性（E）VPS13敲低苍蝇和配对对照中进行攀爬测定。 在每个条上显示的总n。 对于每种基因型，从三个独立的遗传杂交中收集苍蝇。各个数据点代表了这些生物学重复的平均攀爬。 （F-G）控制（圆形符号）和特定于神经元特异性的敲低，红色（F）或特定于肌肉的敲低，蓝色（G）的VPS13（正方形符号）的攀爬测定法。 elav> luc n = 79; elav> vps13（i）n = 68; 24b> luc n = 75; 24b> vps13（i）n = 70。 生物学三份分析的所有样品。 图显示平均值±S.D。 使用未配对的两尾t检验计算出的显着性。 * p <0.05; ** p <0.01; NS =不重要。（b）表现为成年的百分比，与基因型匹配的对照（GAL4具有UAS-luciferase（Luc）（Luc）相比，VPS13的肌肉特异性（24B-GAL4）敲低。n≥50个基因型分析的动物。（c）示意图描绘了成人飞行攀岩测定法，示例为100％攀爬（左）和50％攀爬（右）。在实验中，分析了N〜10的组。（D-E）在3-4天旧的神经元特异性（D）或肌肉特异性（E）VPS13敲低苍蝇和配对对照中进行攀爬测定。在每个条上显示的总n。对于每种基因型，从三个独立的遗传杂交中收集苍蝇。各个数据点代表了这些生物学重复的平均攀爬。（F-G）控制（圆形符号）和特定于神经元特异性的敲低，红色（F）或特定于肌肉的敲低，蓝色（G）的VPS13（正方形符号）的攀爬测定法。elav> luc n = 79; elav> vps13（i）n = 68; 24b> luc n = 75; 24b> vps13（i）n = 70。生物学三份分析的所有样品。图显示平均值±S.D。使用未配对的两尾t检验计算出的显着性。* p <0.05; ** p <0.01; NS =不重要。
自噬激活可以部分挽救蛋白酶体功能障碍介导的心脏毒性
图 1 心脏靶向（Gal4 Τ inC Δ 4 ）蛋白酶体 Pros β 5 基因的 KD 导致蛋白质组不稳定和线粒体数量减少。 (a) Pros β 5 siRNA 后心脏组织中 Pros β 5 基因的相对表达（与对照相比）。 (b, c) Pros β 5 RNAi（与对照相比）果蝇心脏组织中相对 (%) 26S 蛋白酶体活性 (b) 和 ROS 水平 (c)。 (d) Pros β 5 KD 后果蝇心脏组织中蛋白质组泛素化 (Ub) 和羰基化 (DNP) 的免疫印迹分析。 (e) CLSM 观察用 LysoTracker 染色的 Pros β 5 RNAi（与对照相比）果蝇心管（e1）、LysoTracker 定量（e2）和使用溶酶体标记物抗 Lamp1（e3）进行免疫印迹分析。(f) 所示基因型果蝇心脏组织中蛋白酶活性的相对（％）。(g) blw/ATP5A 免疫荧光染色后，CLSM 可视化所示果蝇品系心脏组织中的线粒体；细胞核用 DAPI 复染。(h) Pros β 5 KD 后，所示基因型分离心脏组织中所示线粒体基因的相对表达水平（与对照相比）。在 (a, h) 中，基因表达与相应对照作图；使用 RpL32/rp49 基因作为 RNA 输入参考。 （d）和（e3）中的 Gapdh 和 Actin 探测分别用作蛋白质输入参考。p 值采用非配对 t 检验计算。条形图，± SD（n ≥ 3）；* p < 0.05；** p < 0.01
使用合成的同源供体构建体进行 CRISPR 介导的同源重组，为果蝇基因标记提供扩展工具包
摘要 之前，我们描述了大量果蝇菌株，每个菌株都携带一个人工外显子，其中包含一个基于 CRISPR 介导的同源重组插入目标基因内含子中的 T2AGAL4 盒。这些等位基因可用于多种应用，并且已被证明非常有用。最初，基于同源重组的供体构建体具有较长的同源臂（>500 bps），以促进大型构建体（>5 kb）的精确整合。最近，我们表明，供体构建体的体内线性化使得能够使用短同源臂（100-200 bps）将大型人工外显子插入内含子中。较短的同源臂使得商业合成同源供体成为可能，并最大限度地减少了供体构建体生成的克隆步骤。不幸的是，大约 58% 的果蝇基因缺乏适合所有注释异构体中人工外显子的编码内含子整合。在这里，我们报告了新构建体的开发，这些构建体允许用 KozakGAL4 盒替换缺乏合适内含子的基因的编码区，从而产生与目标基因类似地表达 GAL4 的敲除/敲入等位基因。我们还开发了定制载体骨架，以进一步促进和改善转基因。在包含目标基因 sgRNA 的定制质粒骨架中合成同源供体构建体，无需注射单独的 sgRNA 质粒，并显著提高了转基因效率。这些升级将使几乎所有果蝇基因都能靶向，无论外显子-内含子结构如何，成功率为 70-80%。