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CRISPR-Cas9 介导的精准微生物基因组编辑，借助目标错配的 sgRNA
CRISPR-Cas9 系统彻底改变了基因组编辑。CRISPR-Cas9 由单分子向导 RNA (sgRNA) 和蛋白质 Cas9 核酸酶组成，后者可识别特定靶序列和原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列，然后切割目标 DNA 序列。该 CRISPR-Cas9 系统已被用作有效的负选择工具，用于在位点特异性诱变过程中切割未编辑或未改变的靶 DNA，从而获得具有所需突变的微生物细胞。本研究旨在调查 CRISPR-Cas9 系统在细菌体内寡核苷酸定向诱变中的基因组编辑效率。该系统成功地在大肠杆菌的 galK 中引入了 2 到 4 个碱基的突变，编辑效率很高 (81% − 86%)。然而，单点突变（T504A 或 C578A）很少引入，并且编辑效率非常低（<3％），这可能是由于错配耐受性所致。为了解决这个问题，我们在 sgRNA 序列中设计了一个或两个碱基的错配，以识别大肠杆菌中 galK 的靶序列。使用单碱基错配的 sgRNA，在 36％−95％ 的负向选择的大肠杆菌细胞中成功引入了单点核苷酸突变（galK 基因中的 T504A 或 C578A）。通过使用错配的 sgRNA 的全基因组单碱基编辑实验，随机选择了 16 个靶标。因此，在 48 个所需的单碱基突变中，使用错配的 sgRNA 成功编辑了 25 个单碱基。最后，为微生物基因组中的单核苷酸编辑提供了适用的靶标错配 sgRNA 设计规则。
使用液滴微流体技术进行可扩展且自动化的基于 CRISPR 的菌株工程
摘要 我们提出了一种基于液滴的微流体系统，该系统可在芯片上实现基于 CRISPR 的基因编辑和高通量筛选。微流体装置包含一个 10 × 10 元件阵列，每个元件包含用于两个电场驱动操作的电极组：用于合并液滴以混合试剂的电润湿和用于转化的电穿孔。该装置可以并行执行多达 100 个基因改造反应，为生成遗传途径组合优化和可预测生物工程所需的大量工程菌株提供了一个可扩展的平台。我们通过基于 CRISPR 的两个测试案例的工程改造展示了该系统的能力：（1）破坏大肠杆菌中酶半乳糖激酶（galK）的功能；（2）靶向改造谷氨酰胺合成酶基因（glnA）和蓝色色素合成酶基因（bpsA），以提高大肠杆菌中的靛蓝素产量。
利用 CRISPR/Cas9 系统对弗氏柠檬酸杆菌进行改造
CRISPR/Cas9（成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白）系统是一种快速高效编辑基因组的有用工具。然而，使用 CRISPR/Cas9 编辑细菌基因组仅限于选择主要用于高价值产品生物生产的微生物底盘。因此，需要将 CRISPR/Cas9 工具扩展到其他微生物。在这里，我们的目标是评估 CRISPR/Cas9 对柠檬酸杆菌 ATCC 8090 型菌株基因组编辑的适用性。我们评估了常用的双质粒 pCas/pTargetF 系统，以实现柠檬酸杆菌中的基因删除和插入，并确定了编辑效率。基于 CRISPR/Cas9 的方法对半乳糖激酶 (galk) 的删除具有高编辑效率（~91%），并且能够使用各种单向导 RNA (sgRNA) 序列进行删除。为了评估 CRISPR/Cas9 工具插入基因的能力，我们使用了荧光报告基因 mNeonGreen、内肽酶 ( yebA ) 和转录调节剂 ( xylS )，发现每个基因都以高效率 (81 – 100%) 成功插入。这些结果加强并扩展了 CRISPR/Cas9 基因组编辑在 C. freundii 中的应用，将其作为额外的微生物底盘。
COVID -19疫苗安全更新 - 欧洲药品局
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