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充满信心地创建自己的荧光素酶细胞系。
基础编辑者是一类有希望的下一代基因组编辑技术，具有精确纠正引起疾病的遗传变异的潜力，并同时安全地敲除多个基因靶标。在一种配置中，PIN点碱基编辑平台是DNA结合Cas的模块化组件和DNA修饰的脱氨酶成分，通过在序列靶向指导指南RNA（GRNA）中编码的适体相关的Deaminase组件。通常，基本编辑器在应用中的应用中，可以准确地预测CAS和脱氨酶组合的目标序列的编辑效率和特异性。PIN点底座编辑系统的模块化允许创建大量配置，它们的PAM特异性，序列编辑偏好和编辑效率可能会有所不同。为了促进和加速基于PIN点平台的应用程序的开发，我们创建了一种定制工具来设计GRNA，以针对感兴趣的基因并安装基本转换，包括那些将引入早产停止密码子或破坏剪接站点以敲除目标基因的基础转换。此外，我们进行了一个大规模的平行细胞屏幕，以分析两个不同的针对点基本编辑器配置的编辑活性，其GRNA针对数千个目标序列。我们使用从屏幕获得的数据来构造每种配置的观察到的编辑结果模型。我们将这些模型应用于旨在产生多个临床上相关基因靶标的功能敲除（包括CIITA和PCSK9）的功能敲除。分析了IN硅预测与GRNA基于细胞的性能的相关性后，我们确认该模型预测与Pin-Point Base编辑平台观察到的编辑效率相关。自定义GRNA设计工具和预测模型的组合导致了一种新型，高效的GRNA来识别能够通过破坏剪接站点来敲除PCSK9的识别，我们证实了文献中先前报道的其他GRNA设计的预测性能。使用我们基于细胞的广泛性能数据集告知我们的GRNA设计规则，创建可靠的自定义工具来优先考虑GRNA并选择具有高编辑效率的人。
GB4.0平台，CRISPR/CAS ...
CRISPR/CAS能够同时瞄准多个基因座（多重）的能力是改变植物育种的游戏规则。多路复用不仅会加速性格金字塔，而且还可以揭示功能冗余所隐藏的特征。此外，多路复用增强了基于DCAS的可编程基因表达，并实现了类似级联的基因调节。然而，包含串联阵列导向RNA（GRNA）的多重构建体的设计和组装需要无疤的克隆，并且由于存在重复序列而仍然很麻烦，从而阻碍了更广泛的使用。在这里，我们介绍了软件辅助克隆平台Goldenbraid（GB）的全面扩展，其中除了其多基因克隆软件之外，我们将新的工具集成了新的工具，用于基于IIS的易于且六个串联阵容的GRNA，使用Cas9和cas12a，使用GRNA-trees-trees-trees-crrna-crrrna-crrrna和crrrnna crrrnna crrrnna crrrnna crrrna carrna-crrrna crrrna cas12a。作为新工具的应力测试，我们组装并用于农杆菌介导的稳定转化A 17 cas9-grnas构造，靶向烟草中的Squamosa-promoter结合蛋白样（SPL）基因家族的子集。14个选定的基因是miR156的靶标，因此在少年到成年和营养至生殖相变中可能起重要作用。使用17个grnas构建体，我们生成了一组无Cas9的SPL编辑的T 1植物，该植物携带了多达9个双重突变，并显示出叶少年和更多的分支。GB4.0 Genome Edition纳入了新的基于Web的工具和随附的DNA零件集合，为植物基因组工程提供了多合一的开放平台。使用荧光素酶lyanum lycopersicum mtb促进剂或Agrobacterium tumefaciens Nopaline benthase prospermers inice inice inice Amamaine inice Amamaine in NiceAtient在NICAPASE中，NICAPASE PROSSITER in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICASIEN中，NICAIN中的使用单个和多重GRNA的GB组装DCAS9和基于DCAS12A的CRISPR/CAS激活剂和阻遏物使用单一和多路复用GRNA的功能。使用单个和多重GRNA的GB组装DCAS9和基于DCAS12A的CRISPR/CAS激活剂和阻遏物使用单一和多路复用GRNA的功能。
CRISPR-CAS裂解测定
研究人员经常依靠Silico CRISPR计算设计算法来产生高性能的GRNA，但仍会在体内经历编辑故障。我们的另一个客户就是这种情况，一个研究团队开发了转基因无菌男性蚊子来打击疟疾的传播。他们的基因编辑实验经常失败，导致大量延迟，每个失败的实验都将项目恢复了8到12个月。在此问题上与他们合作，我们使用CRISPR Analytics平台来量化两个GRNA候选者的扩增子裂解活性。数据表明，两个GRNA都表现出裂解活性在远高于阴性对照的水平上，其中一个GRNA显示出大约是另一个活性的两倍（图2A）。
CRISPR/DCAS9工具包用于玉米基因的功能分析
确实有效。使用基于DCAS9（PDA2），DCAS9-VP64（PDA3）或DCAS9-SRDX（PDA4）载体的CRISPRA/CRISPRI原生质体系统，我们测试了前四个GRNA候选者的有效性，靶向PDS1，CHLH和TRXH和TRXH，FICE（FICE）和3和TRXH，FICE（FICE）和3（FICE）2及3次。与其他关于DCAS9活性的报道类似，我们观察到PDA2在CHLH表达上表现出一些抑制活性（图3A），尽管对于某些GRNA，PDA4的幅度较大（图3B）。用PDA3（CRISPRA构建体）测试，表明TRXH表达增加了两倍，具体取决于GRNA共转染了哪个GRNA（图3C）。这项研究中观察到的GRNA之间的有效性不同，重申了测试多个候选物的必要性。
改进的 gRNA 二级结构允许编辑抵抗 CRISPR-Cas9 切割的靶位
CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑的第一步是切割与 CRISPR 向导 RNA (gRNA) 中所谓的间隔序列互补的目标 DNA 序列。然而，一些 DNA 序列对 CRISPR-Cas9 切割具有抵抗性，这至少部分是由于 gRNA 折叠错误造成的。为了解决这个问题，我们设计了 gRNA，使其恒定部分具有高度稳定的发夹结构，并通过化学修饰进一步增强了它们的稳定性。“基因组编辑优化锁定设计”(GOLD)-gRNA 将基因组编辑效率提高了约 1000 倍（从 0.08% 到 80.5%），其他不同靶标的平均效率提高了 7.4 倍。我们预计，无论间隔序列组成如何，这种改进的 gRNA 都将实现高效编辑，并且在所需的基因组位点难以编辑时将特别有用。
具有提高AAV生产率的新的T抗原负HEK293细胞系
图1Hekexpress®细胞的基因型表征。（a）使用靶向T抗原编码序列的引物（集1）的引物，跨Hekexpress®基因组的TLA序列覆盖率。绘图表明质粒的积分位点位于3染色体等效物（CHR3）上。（b）使用针对T抗原编码序列（集1）或CHR3（集3和4）的引物（集3和4）的引物（集3和4）的引物，（b）在人类CHR3中整合基因座的TLA序列覆盖率。 集合1的覆盖范围表明，与人类HG38基因组相比，Hekexpress®基因组（绿色箭头）中的550 kb缺失。 集合3和4的覆盖范围确认了综合质量PRTAK的连接。 （c）PRTAK质粒图最初集成在Hekexpress®细胞系中。 大小的T抗原序列在橙色的基因中，在深紫色和grnas（grna_beginning和grna_end）中指示。 （d）Chr3等效（红色）的图与550 kb缺失以及包含T抗原序列的PRTAK质粒的整合。 由TLA证实的质粒 - 染色体连接均以蓝色指示。 Hek，人类胚胎肾； TLA，靶向基因座放大。（b）在人类CHR3中整合基因座的TLA序列覆盖率。集合1的覆盖范围表明，与人类HG38基因组相比，Hekexpress®基因组（绿色箭头）中的550 kb缺失。集合3和4的覆盖范围确认了综合质量PRTAK的连接。（c）PRTAK质粒图最初集成在Hekexpress®细胞系中。大小的T抗原序列在橙色的基因中，在深紫色和grnas（grna_beginning和grna_end）中指示。（d）Chr3等效（红色）的图与550 kb缺失以及包含T抗原序列的PRTAK质粒的整合。由TLA证实的质粒 - 染色体连接均以蓝色指示。Hek，人类胚胎肾； TLA，靶向基因座放大。
Leptomonas pyrrhocoris的完整微圆基因组揭示了其非典型的线粒体RNA编辑事件的来源
尿苷插入 /缺失（U-Indel）编辑Mito-Condrial mRNA，Protistan类Kine-toplastea独有的，生成规范和潜在的非生产性编辑事件。虽然分子机制和为U-Indel编辑提供所需信息的指南（G）RNA的作用有充分的了解，但对不限制其明显易错的性质的力鲜为人知。对GRNA的分析：mRNA对允许在给定线粒体转录的给定位置解剖编辑事件。一个完整的GRNA数据集，与包括非平均编辑转录物在内的完全表征的mRNA群体配对，将允许在整个小节转录组中全球进行此类分析。为了实现这一目标，我们组装了67个昆虫寄生虫Lep- tomonas pyrrhocoris的微量圆，每个微圆通常编码一个位于两个不同来源的两个相似单元之一中的一个GRNA。在相对较低的注释的grnas中，我们已经解剖了L. pyrrhocoris中的所有识别线粒体编辑事件，其菌株在各个微量圆形类别的丰富度上截然不同。我们的资产支持一个模型，其中许多编辑事件由有限的GRNA驱动，而自发的GRNA具有指导规范和非统计编辑的固有能力。
改进的 gRNA 二级结构允许编辑抵抗 CRISPR-Cas9 切割的靶位
CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑的第一步是切割与 CRISPR 向导 RNA (gRNA) 中所谓的间隔序列互补的目标 DNA 序列。然而，一些 DNA 序列对 CRISPR-Cas9 切割具有抵抗性，这至少部分是由于 gRNA 折叠错误造成的。为了解决这个问题，我们设计了 gRNA，使其恒定部分具有高度稳定的发夹结构，并通过化学修饰进一步增强了它们的稳定性。“基因组编辑优化锁定设计”(GOLD)-gRNA 将基因组编辑效率提高了约 1000 倍（从 0.08% 到 80.5%），其他不同靶标的平均效率提高了 7.4 倍。我们预计，无论间隔序列组成如何，这种改进的 gRNA 都将实现高效编辑，并且在所需的基因组位点难以编辑时将特别有用。
CRISPR-Cas9 介导诱导人类支气管上皮细胞发生大型染色体倒位
1. 通过 UCSC 基因组浏览器 ( https://genome.ucsc.edu/ ) 可获得用于设计两个 gRNA 的目标 DNA 序列。a. 选择感兴趣的基因组版本。在我们的例子中，使用的是“人类 GRCh38/hg38”。b. 根据已知的倒位断点 1 的位置，标记断点前 100-150 bp 到断点后 100–150 bp 范围内的基因组区域。例如，如果断点 1 位于 chr3:2,920,305，则在 UCSC 基因组浏览器搜索框中输入“chr3:2,920,205–2,920,405”以标记所需的染色体区域，然后单击“Go”。c. 在 UCSC 基因组浏览器工具栏上选择“查看”，然后单击“DNA”选项。d.在新窗口中，单击“获取 DNA”以获得准确的 DNA 序列。这是使用 CRISPOR 算法设计 gRNA 引物所需的序列（见下面的步骤 2a）。e. 对倒位的断点 2 重复步骤 1a-1d。2. 要设计 gRNA，请使用 CRISPOR 算法（http://crispor.tefor.net/）：a. 输入从步骤 1d 获得的断点 1 的 DNA 序列。确保参考基因组与 UCSC 浏览器（步骤 1a）中使用的基因组相匹配，然后选择可通过转染载体编码的 Cas9 酶类型识别的 Protospacer Adjacent Motif (PAM)。如果转染载体表达 SpCas9，则选择 20 bp-NGG PAM 格式。单击“提交”以获得针对模板 DNA 的候选 gRNA 序列。b. CRISPOR 算法默认按特异性从高到低对候选 gRNA 序列进行排序，因为这是关键参数。从新页面上出现的候选 gRNA 列表中，选择具有最高麻省理工学院 (MIT) 和切割频率确定 (CFD) 特异性得分的指导序列（Doench 等人，2016 年；Hsu 等人，2013 年；Tycko 等人，2019 年）。这些分数根据以下方面评估候选 gRNA
使用 TrueDesign 基因组编辑器中的长插入工作流程将 GFP 序列插入 TRAC 基因座
8. TrueDesign 基因组编辑器将显示优先设计为最接近预期编辑位置（最多 40 bp 距离）的 gRNA 和供体 DNA。gRNA 距离编辑位置越远，敲入效率越低。所有设计的供体 DNA 序列（现在包括同源臂）都将接受 GeneArt 基因合成制造可行性检查。如果供体 DNA 未通过检查，您将无法选择该 gRNA，并且该行将变灰。在这种情况下，请选择不同的 gRNA 或 TALEN 对（如果可用），或更改插入位置或同源臂长度。对于每个 CRISPR-Cas9 gRNA 和 TALEN 对，可以通过单击供体 DNA 列中的眼睛图标来查看供体 DNA 序列。要在您选择的克隆软件中查看和注释供体 DNA 序列，请单击供体 DNA 列中的下载图标下载 FASTA 文件。确保供体 DNA 位于框架内以实现 GFP 的最佳表达。