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体内腺嘌呤碱基编辑恢复了C282Y并改善了血色素沉重小鼠的铁代谢
血色素沉着症是白人种群中最常见的遗传代谢疾病之一，主要起源于HFE基因中的纯合C282Y突变。g>在基因的845位置的转变会导致HFE蛋白的折叠折叠，最终导致其在细胞膜上不存在。因此，与转素受体1和2缺乏相互作用导致系统性铁超载。我们在高度精确的细胞培养分析中筛选了潜在的GRNA，并应用了表达腺嘌呤基础编辑器ABE7.10的AAV8拆分矢量，并在129- HFE TM.1.1.1NCA小鼠中筛选了我们的候选GRNA。在这里，我们表明我们的治疗载体单次注射导致基因校正率> 10％，并且肝脏中铁代谢的改善。我们的研究提出了针对影响人类最常见的遗传疾病之一的靶向基因矫正疗法的概念验证。
在甘蓝纳普斯中的myb基因的编辑是增加花色素色素沉着和胁迫耐受性的一种方法
摘要。nthocyanin高蓄能是一种重要的农业特征，与对非生物胁迫，害虫，植物致病性真菌和细菌性疾病的抗性有关。B. Napus随着基因组编辑而产生的花色素色素化增加。MYB家族的许多转录因子都参与压力反应和花青素生物合成。基因ATMYB60，ATCPC和ATMYBL2是拟南芥中花青素生物合成的负调节剂，因此这些基因的敲除可以导致花呢素色素沉着增加。GRNA垫片合成以靶向这些基因的直系同源物，这些基因在甘蓝甘蓝中鉴定出来。通过农业浸润将遗传构建体引入植物组织。靶向myb转录因子的DNA结合结构域的GRNA的瞬态表达以及CAS9核酸酶成功促进了花青素的高蓄积。这些遗传构建体可用于基因组编辑和生产新的有色和胁迫的油料种子强奸品种。
使用 GuideScan2 进行全基因组 CRISPR 引导 RNA 设计和特异性分析
基于 CRISPR 的技术已经改变了生命科学，并在治疗学开发中显示出良好的前景 [1]，全基因组 CRISPR 筛选通常用于无偏识别各种细胞表型的调节因子。然而，为基于 CRISPR 的基因组扰动设计高效且特异的向导 RNA (gRNA) 带来了计算挑战。不必要的 gRNA 脱靶会导致靶向效率低下以及产生基因毒性，而脱靶信息不完整会导致实验结果的误解 [2]。我们之前开发了 Guide-Scan [3] 用于可扩展的 gRNA 设计，我们和其他人已经证明 GuideScan 在枚举潜在脱靶和估计 gRNA 特异性方面比其他工具更准确 [3, 2]。一个关键的观察结果是，其他 gRNA 设计工具使用的短读比对器虽然对于典型的读取计数量化任务非常有效，但不能详尽地计算次优比对，甚至不能计算多个读取。
艾滋病新疗法
艾滋病是一种每年导致一百多万人死亡的传染病。最近，Dash 等人首次使用 CRISPR-Cas9 结合 LASER ART 在 HIV 感染的人源化小鼠中实现了功能性治愈，成功率达到三分之一。在这里，我使用理论方法设计了一种适用于人类的治疗策略，与 Dash 等人的治疗策略不同。这里介绍的实验性治疗包括注射 Env 定向整合酶缺陷型 CRISPR 基因编辑慢病毒载体（能够表达五重 gRNA）以及人源化 SpCas9 和由 T2A 连接的嘌呤霉素抗性基因，然后进行血浆/白细胞分离术和注射免疫抑制混合物，然后进行体内正向选择。我的方案如果通过临床试验得到证实，可能会对艾滋病毒感染者产生重大影响，并且有可能成为治疗艾滋病的参考方案，尽管目前它还处于假设和理论阶段。
编辑 γ 珠蛋白阻遏物结合位点可恢复胎儿血红蛋白合成并纠正镰状细胞病表型
镰状细胞病 (SCD) 是由成人血红蛋白 (Hb) 链中的单个氨基酸变化引起的，这种变化会导致 Hb 聚合和红细胞 (RBC) 镰状化。导致胎儿 珠蛋白在成年期产生的突变共同遗传，胎儿 Hb 的遗传性持续性 (HPFH) 降低了 SCD 的临床严重程度。HBG 珠蛋白启动子中的 HPFH 突变会破坏阻遏物 BCL11A 和 LRF 的结合位点。我们使用 CRISPR-Cas9 通过产生插入和缺失来模拟 HBG 启动子中的 HPFH 突变，从而导致已知和推定的阻遏物结合位点的破坏。编辑患者来源的造血干/祖细胞 (HSPC) 中的 LRF 结合位点可导致 珠蛋白去阻遏和镰状表型的纠正。用靶向 LRF 结合位点的 gRNA 处理的 HSPC 异种移植在重新植入 HSPC 方面表现出较高的编辑效率。这项研究确定了 LRF 结合位点是基因组编辑治疗 SCD 的有力靶点。
勘误表：高效基因编辑策略......
图 1 | 葡聚糖水二激酶 (GWD) 1 — gRNA 靶区的结构和完整等位基因序列。上图为外显子（方框）和包含碳水化合物结合模块 (CBM) 的区域的整体基因结构。左图：外显子 1 和内含子的核苷酸序列。右图：外显子 24 和 25，包括内含子。外显子以大写字母表示，并标明氨基酸序列。SPUD 数据库中包含的品种的小核苷酸多态性 (SNP) 以红色标记，Saturna 中发现的 SNP 以下划线表示。灰色箭头表示 gRNA（gA、gB、gC、gD、gE、gI、gJ、gK、gL 和 gM），其中 PAM 位点以粗体标记。红色箭头表示诊断性 IDAA PCR 引物。 “ CFATC ” 区域含有半胱氨酸，据推测该区域参与二硫键间或二硫键内形成，因此推测参与 GWD 活性的氧化还原状态调节，该区域以粗体标记。活性位点组氨酸残基也以粗体标记。
本氏烟羟化酶亚家族
图 1 本研究针对的四种脯氨酰-4-羟化酶-4 ( NbP4H4 ) 基因、用于靶向它们的 gRNA 以及显示关键元素的二元载体 pBV113 的一部分的示意图。基因以示意图形式绘制，左下图中扩大了前三个外显子（框）和内含子（虚线），以显示八个 gRNA 的靶位。G3（红色）靶向所有四个基因，而其他七个基因（G1、G2、G5 和 G6 为绿色，表示它们未用于稳定转化实验，G4 为蓝色，G7 为粉色，G8 为橙色）则特定于 NbP4H4_1 和 NbP4H4_2 。右下图显示了二元载体 pBV113 的一部分，其中显示了 NbP4H4_1 中 gRNA 位点周围的关键元素。包含 G3 的编辑盒由黄叶卷曲病毒 (CmYLCV) 启动子驱动，并插入二元载体的 SapI 位点。处理系统包括 Csy4 位点以及优化的 gRNA 支架 (osgRNA)
一种简单有效的 F0 敲除方法，用于快速筛选行为和其他复杂表型
摘要 数百种人类基因与神经系统疾病有关，但将其转化为可处理的生物机制却滞后。斑马鱼幼体是研究神经系统疾病遗传贡献的有吸引力的模型。然而，目前的 CRISPR-Cas9 方法难以应用于研究行为表型的大规模遗传筛选。为了促进快速遗传筛选，我们开发了一种简单的无测序工具来验证 gRNA，并开发了一种高效的 CRISPR-Cas9 方法，能够将 90% 以上的注射胚胎直接转化为 F0 双等位基因敲除。我们证明 F0 敲除可靠地重现复杂的突变表型，例如改变的昼夜节律分子节律、对刺激物的逃避反应以及多参数昼夜运动行为。该技术足够强大，可以敲除同一动物中的多个基因，例如创建用于成像的透明三重敲除水晶鱼。我们的F0敲除方法将斑马鱼从基因到行为表型的实验时间从数月缩短至一周。
ASPSCR1-TFE3 调控肺泡软组织肉瘤的血管生成程序
并且肿瘤中超过5个gRNA减少2倍的63个基因座被认为是阳性候选者（图4b，扩展数据图4c和补充表9）。通过Hi-C分析定义拓扑相关域（TAD）（图4c），并选择与每个SE包含在同一TAD中的345个候选靶基因。通过在ASPS-null细胞中下调的表达和功能注释进一步选择了56个候选基因（图4d和补充表10）。对Ccbe1、Pdgfb、Rab27a、Syngr1、Sytl2和Vwf六个候选基因进行了体内验证试验（扩展数据图4d）。验证每个基因有效敲除后（扩展数据图4e），将肿瘤克隆移植到裸鼠体内。尽管体外增殖率相当（扩展数据图 4f），但 Pdgfb、Rab27a、Sytl2 和