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Cas-CLOVER™：一种高保真基因组编辑系统...
与使用单个向导 RNA (gRNA) 进行序列特异性引导 CRISPR/Cas9 结合和切割相反，Cas-CLOVER™ 系统使用双 gRNA 引导核酸酶，其中酶的每个半位点亚基都含有催化无活性的 Cas9 (dCas9) 和 IIS 型限制性内切酶 Clo51 的融合蛋白。与广泛用于 TALEN 和锌指核酸酶 (ZFN) 的 FokI 一样，Clo51 活性取决于二聚体的形成，因此 DNA 切割严格依赖于特定距离内两个不同的 gRNA 引导内切酶同时靶向结合。虽然当两个半位点 gRNA 共同递送至细胞时观察到酶的高切割效率，但当单独递送任一半位点 gRNA 时，在原代人类 T 细胞中未观察到靶向破坏。此外，直接比较T细胞中的野生型（WT）CRISPR/Cas9和Cas-CLOVER™表明，在同一基因位点，两种系统都能高效编辑基因组。
当前的 gRNA 排序预测算法对植物基因组编辑有用吗？
通过传统育种将新特性引入作物通常需要几十年的时间，但最近开发的基因组序列修饰技术有可能加速这一过程。这些新育种技术之一依赖于 RNA 指导的 DNA 核酸酶 (CRISPR/Cas9) 在体内切割基因组 DNA，以促进序列的删除或插入。这种序列特异性靶向由向导 RNA (gRNA) 决定。然而，选择最佳 gRNA 序列有其挑战。几乎所有当前用于植物的 gRNA 设计工具都是基于动物实验数据，尽管许多工具允许使用植物基因组来识别潜在的脱靶位点。在这里，我们检查了八种不同的在线 gRNA 位点工具的预测一致性和性能。不幸的是，不同算法的排名之间几乎没有共识，排名与体内有效性之间也没有统计学上显着的相关性。这表明，影响植物中 gRNA 性能和/或靶位点可及性的重要因素尚未阐明并纳入 gRNA 位点预测工具中。
纳伊姆，法蒂玛
通过传统育种将新特性引入作物通常需要几十年的时间，但最近开发的基因组序列修饰技术有可能加速这一过程。这些新育种技术之一依赖于 RNA 指导的 DNA 核酸酶 (CRISPR/Cas9) 在体内切割基因组 DNA，以促进序列的删除或插入。这种序列特异性靶向由向导 RNA (gRNA) 决定。然而，选择最佳 gRNA 序列有其挑战。几乎所有当前用于植物的 gRNA 设计工具都是基于动物实验数据，尽管许多工具允许使用植物基因组来识别潜在的脱靶位点。在这里，我们检查了八种不同的在线 gRNA 位点工具的预测一致性和性能。不幸的是，不同算法的排名之间几乎没有共识，排名与体内有效性之间也没有统计学上显着的相关性。这表明，影响植物中 gRNA 性能和/或靶位点可及性的重要因素尚未阐明并纳入 gRNA 位点预测工具中。
利用 CRISPR/Cas9 破坏大黄鱼 (Larimichthys crocea) 中的 mstn 基因
mstnab +/− 鲤鱼的体长显著增加（Shahi et al.，2022），为经济鱼类的养殖产量提供了有希望的方向。因此，我们选择大黄鱼的mstnb作为靶基因。经检测，我们设计的针对外显子1中编码序列的8个靶标中的两个sgRNA是有效的（图1b）。与野生型鱼中的序列相比，检测到了5个缺失突变，包括同时发生的12 bp、28 bp、36 bp、83 bp和97 bp缺失（图2c）。与单个gRNA微注射（Shahi et al.，2022，Tao et al.，2021，Zhang et al.，2020b）不同，同时注射多个gRNA可能诱导两个靶位点之间更大片段的缺失（图2c）。该方法也被考虑并应用于斑马鱼视网膜疾病模型研究中，采用基于CRISPR/Cas9系统的更快速有效的策略
角质形成细胞感知并通过刺激/IFN-κ激活和APOBEC3G诱导消除CRISPR DNA
引言角质形成细胞（KC）长期以来一直被认为是转染最困难的细胞类型之一（1，2），但是这种耐药性背后的机制尚不清楚。kc是表皮的主要细胞成分，它充当人体和外部药物（例如细菌和病毒）之间的主要界面。除了对上皮真皮作为物理屏障的关键贡献之外，KC还通过一系列模式受体和分泌各种细胞因子的能力具有非常活跃的免疫作用（3）。原核生物衍生的定期插入短的短质体重复序列（CRISPR）/CAS9技术改变了我们操纵活细胞中特定DNA和RNA序列的能力（4）。CRISPR/CAS9系统依赖于引导RNA（GRNA）来靶向特异性和功能，通过产生焦油的DNA断裂，从而通过各种内源性机制刺激修复。CRISPR技术可用于通过非同源最终连接途径或通过同源性编辑的单基结合途径插入或删除小型DNA段 -
双TAP基因驱动器使用迭代基因组靶向来帮助克服抗性等位基因
HOHING CRISPR基因驱动器可以帮助遏制媒介传播疾病的传播，并由于遗传率通过了孟德尔法律而控制作物害虫和入侵物种种群。然而，这项技术遭受了当驱动诱导的DNA断裂通过错误的途径修复时形成的电阻等位基因，这会产生破坏GRNA识别序列并阻止进一步基因驱动过程的突变。在这里，我们试图通过编码针对基因驱动器中最常见的抗性等位基因的其他GRNA来抵消这一点，从而在基因驱动转换时进行了第二次反应。我们提出的“双击”策略通过回收阻力等位基因改善了驱动效率。双击驱动器还有效地在笼中的种群中扩散，表现优于控制驱动器。总体而言，这种双重tap策略可以在任何基于CRISPR的基因驱动器中很容易实现，以提高性能，并且类似的绝对能力可以使其他患有低HDR频率的系统（例如哺乳动物细胞或小鼠种系转换）。
构建CRISPR/CAS9载体沉默番茄CIF1基因 Dao Quang Ha 1, Nguyen Thi Bich Ngoc 1, Huynh Thi Thu Hue 1,2* 1 研究所
收到日期：2021 年 11 月 8 日 番茄 ( Solanum lycopersicum ) 是一种营养丰富的食物，含有各种次生化合物，对健康有很大益处。番茄果实的糖含量部分是通过调节和分解果实和发育过程中的蔗糖来控制的。细胞壁转化酶 (CWI) 将蔗糖水解成单糖并将其运输到细胞质中，这意味着番茄的糖含量受 CWI 调控。同时，由于这种基因抑制是由 CIF1 基因的产物诱导的，因此 CIF1 基因的失活可能会增强番茄中的糖合成。目前，CRISPR/Cas9 系统是一种最先进的技术，在基因编辑方面具有广泛的应用和高精度。在本研究中，设计了适合 CIF1 基因的 gRNA 来构建表达构建体。将 pRGEB31-CIF1G2 质粒中的该表达系统引入到 DH10B 大肠杆菌菌株中。随后，携带该表达系统的载体成功转移到EHA105农杆菌菌株中。进一步地，含有载体pRGEB31-CIF1G2的农杆菌株系可用于在基因编辑的Tiny-Tim番茄株系中产生所需性状。
应用能量
实验室进化是一种强大的方法，可以寻求对新表型的遗传适应性，但要么依赖于劳动力和选择的劳动密集型人类引导的迭代回合，要么基于自然发展的细胞种群，或者延长了适应状态。在这里，我们使用不断发展的嵌合供体GRNA持续从错误的t7 RNA聚合酶传递，并直接将作为RNA维修供体引入基因组ther cas9或DCAS9指南，并直接引入了基因组供体的GRNA，并在此处提供了CRISPR和RNA辅助在基因组基因座的体内进化（Craide）。我们通过进化辅助标志物基因的新功能变异，并通过在贝克酵母囊中对有毒氨基酸类似物的抵抗力，并以较高的延长的速度表明了较高的信息，从而提高了较高的速度，从而使自发性的速度更高，从而使无效的转移表明了viv viv viv viv viv viv viv viv， RNA供体模板不使用体外提供和预先编程的重对供体，为基因组环境。
使用EXO-CIP™快速PCR清理套件处理的PCR扩增子对基因组编辑效率进行快速分析，然后是Sanger测序
对于CRISPR/CAS工作流程，核酸酶和相应GRNA的选择直接影响基因组编辑后的indel频率的计算。当前用于评估编辑效率的当前METH OD使用来自转染的细胞的合并GDNA的PCR扩增，然后是基于测序或基于测序的基于测序或基于不匹配的裂解的分析分析的变性和重新启动的indneal indneal indneal DNA（4）。为加快编辑效率的确定并避免昂贵的NG测序，“通过分解来跟踪Indels”（Tide）（5）和“ CRISPR编辑的推断”（ICE）方法（6）是开发用于使用sanger sequenc dna sequenceenc dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna（ice）方法（ICE）方法（ICE）方法（ICE）。但是，要使这些方法可靠，分析的PCR产品必须具有高质量（例如，单个频带，没有底漆和DNTP）。在本文中，我们证明了通过Exo-CIP快速PCR清洁套件方法清理的扩增子质量匹配，该方法是通过使用ICE软件工具进行批处理分析的传统基于旋转柱的套件来实现的，从而启用了更快，更高的推出方法，以制备旋转后的样品，用于旋转后的样品。
使 ipsc 衍生细胞疗法的设计成为可能...
并表征重组 MAD7 以用于我们 iPSC 基因编辑平台中的核糖核蛋白 (RNP)。我们的工艺产生的蛋白质在配制后在溶液中是均质和单体的。此外，通过生物物理和功能表征测量，蛋白质稳定性在 -8080 C 下保持 6 个月。重组产生的 MAD7 的活性在 iPSC 中多个基因座的敲除 (KO) 和同源定向修复 (HDR) 效率方面与 Cpf1 相当。我们已经生成并测试了针对基因组中不同位点的多个 gRNA，并证明 MAD7 不会引起任何结构异常，这通过正交遗传表征测定确定。数据表明，重组 MAD7 CRISPR 核酸酶可以有效表达、纯化和配制，从而能够将哺乳动物细胞稳健而精确地改造为核糖核蛋白 (RNP)。我们目前正在使用我们的 MAD7 优化工艺来生成 MAD7 RNP，以便对具有多个基因编辑的治疗性 iPSC 衍生的 NK 和 T 细胞候选产品进行基因工程改造。Hunter Hoffman、Jill M. Carton、Buddha Gurung、Justin Bianchini、Shelby Keating、Michael F. Naso、Luis Borges